Les légumineuses peuvent interagir avec les bactéries du sol de la famille des Rhizobiaceae. Cette interaction aboutit à la formation d'un organe spécialisé appelé nodosité. Au sein des cellules symbiotiques des nodosités, les rhizobia sont capables de fixer l'azote atmosphérique et de la convertir en ammoniac, qui est une source d'azote assimilable par les plantes. Chez la Légumineuse Medicago truncatula, les cellules symbiotiques produisent une large famille de peptides riches en cystéines appelées (NCRs) spécifiquement exprimés dans les nodosités. Ces NCRs induisent la différenciation des bactéroïdes qui se traduit par un allongement cellulaire couplé à une forte endoréplication du génome (les bactéroïdes deviennent polyploïdes) contribuant ainsi à une augmentation importante de la taille des cellules, ainsi qu’une perméabilité membranaire accrue et une perte de toute capacité reproductrice. Les peptides NCRs ressemblent à des défensines, des peptides antimicrobiens, acteurs clés de l’immunité innée. L'analyse de l'expression de 334 gènes NCR dans 267 différentes conditions expérimentales en utilisant la base de données MtGEA (Medicago truncatula Gene Expression Atlas) a révélé que l'ensemble des gènes NCR testés (sauf quatre) n'est exprimé que dans les nodosités, ils ne sont pas exprimés dans d’autres organes de la plante, ni lors d’une infection par des agents pathogènes. De plus l’expression des NCRs n’est induite en réponse à aucune interaction biotique ou abiotique testée ou à des facteurs Nod. Les gènes NCR sont activés en vagues successives au cours de l’organogenèse nodulaire et ce profil temporel est en corrélation avec une localisation spatiale spécifique de leurs transcrit de la zone apicale à la partie proximale de nodosités. En outre, nous avons montré que les NCRs ne sont pas induites pendant la sénescence des nodules. Ces analyses expérimentales ensemble avec des calculs d’entropie de Shannon, une métric pour la spécificité d’expression, montrent que les gènes NCR sont parmi les gènes les plus fortement et le plus spécifiquement exprimés chez M. truncatula. Ainsi, l'expression des NCRs est soumise à une régulation extrêmement stricte et ils sont activés exclusivement pendant l’organogenèse et au cours du développement nodulaire dans les cellules symbiotiques polyploïdes. Cette analyse a suggéré l'implication de la régulation épigénétique des gènes NCR. La formation des cellules symbiotiques s'exerce par une endoreplication et est associée à une reprogrammation transcriptionnelle. En utilisant le tri par cytométrie en flux des noyaux, en fonction de leur contenu en ADN, nous avons montré que les vagues transcriptionnelles sont en correlation avec les niveaux croissants de ploïdie et resultent des modifications épigénétiques durant les cycles d’endoréplication. Nous avons étudié la méthylation de l'ADN génomique et l'accessibilité à la chromatine, ainsi que la présence des marqueurs répresseurs (H3K27me3) ou activateurs transcriptionnels (H3K9ac) sur des gènes spécifiques des nodosités. La méthylation différentielle de l'ADN n'a été trouvée que dans un petit sous-ensemble de gènes symbiotiques spécifiques aux nodosités. Néanmoins, plus que la moitié des gènes NCR était différentiellement méthyles. D'autre part, l'expression des gènes était corrélée avec la décondensation de la chromatine (ouverture), un enrichissement du marqueur H3K9ac et une diminution du marqueur H3K27me3. Nos résultats suggèrent que l’endoréplication, pendant la différenciation cellulaire dans les nodosités, fasse partie des mécanismes qui lèvent l’inactivation transcriptionnelle des gènes spécifiques des nodosités, ceci résultant de modifications des codes épigénétiques au niveau de la chromatine. / Legume plants are able to interact with soil bacteria from the Rhizobiaceae family. This interaction leads to the development of a specialized organ called root nodule. Inside the symbiotic nodule cells, rhizobia are capable to fix atmospheric nitrogen and convert it to ammonia, which is a usable nitrogen source for the plant. In the legume Medicago truncatula the symbiotic cells produce high amounts of Nodule-Specific Cysteine-Rich (NCR) peptides which induce differentiation of the rhizobia into enlarged, polyploid and non-cultivable bacterial cells. NCRs are similar to innate immunity antimicrobial peptides. The NCR gene family is extremely large in Medicago with about 600 genes. The expression analysis of 334 NCR genes in 267 different experimental conditions using the Medicago truncatula Gene Expression Atlas (MtGEA) revealed that all the NCR genes except five are exclusively expressed in nodules. No NCR expression is induced in any other plant organ or in response to biotic, abiotic stress tested or to Nod factors. The NCR genes are activated in consecutive waves during nodule organogenesis, which correlated with a specific spatial localization of their transcripts from the apical to the proximal nodule zones. Moreover, we showed that NCRs are not induced during nodule senescence. According to their Shannon entropy, a metric for tissue specificity, NCR genes are among the most specifically and highest expressed genes in M. truncatula. Thus, NCR gene expression is subject to an extreme tight regulation since they are only activated during nodule organogenesis in the polyploid symbiotic cells. This analysis suggested the involvement of epigenetic regulation of the NCR genes. The formation of the symbiotic cells is driven by endoreduplication and is associated with transcriptional reprogramming. Using sorted nodule nuclei according to their DNA content, we demonstrated that the transcriptional waves correlate with growing ploidy levels and investigated how the epigenome changes during endoreduplication cycles. We studied genome-wide DNA methylation and chromatin accessibility as well as the presence of repressive H3K27me3 and activating H3K9ac histone tail modifications on selected genes. Differential DNA methylation was found only in a small subset of symbiotic nodule-specific genes, including over half of the NCR genes, while in most genes DNA methylation was unaffected by the ploidy levels and was independent of the genes’ active or repressed state. On the other hand, expression of these genes correlated with ploidy-dependent opening of the chromatin and in a subset of tested genes with reduced H3K27me3 levels combined with enhanced H3K9ac levels. Our results suggest that endoreduplication-dependent epigenetic changes contribute to transcriptional reprogramming in differentiation of symbiotic cells.

The process of embryogenesis is governed by the expressions of groups of genes which are acting in a coordinate way. Uncovering how the expressions of these genes control the development of a multicellular organism is fundamental for developmental biology. Gene expression atlases could capture quantitative spatio-temporal information of all genes expressed in a developing embryo. In other words, they could reveal the underlying genetic activity during the embryogenetic processes by providing information about, apart from how much and which, where and when the genes are expressed at cellular level and the interactions between them. The extraction of relative gene expression data and their simultaneous study in animal models, such as zebrafish, would be greatly facilitated by the existence of such atlases. This Master Thesis focuses on the early zebrafish embryogenesis and its goal is to design and implement an image processing framework that will provide the means to gather the expression patterns of different genes from different embryos at a given developmental stage into a common template. The framework should work with image-based data from different embryos, each fluorescently stained to label nuclear DNA and the expression patterns of a reference gene and another gene of interest. The volumetric data from each fluorescent label are contained in different channels. Therefore the crux of the framework lies in its ability to combine appropriately the information from the different channels and deal with a three-dimensional image registration problem. The implemented framework works with datasets of two embryos, one that serves as a template and depicts a whole embryo and another that has to be aligned with the first and depicts part of the other embryo. It is composed of different steps, responsible for preprocessing the channels, coarsely positioning the partial embryo view in the three dimensional template’s space and determining the geometrical transformation that finally aligns it with the template using as reference the gene expression pattern common to all labelled embryos. The resulting transformation is used to map the second expression patterns, thus producing their spatial expression atlas. The algorithm developed is based on the Insight Segmentation and Registration Toolkit. The framework was evaluated with data from six embryos at the same developmental stage and four different registration methods were compared in terms of performance. Visual inspection of the results identified the combination of the correlation coefficient, as a similarity measure function between two images, with the gradient descent optimization algorithm as the most appropriate method for this specific application. The final results obtained showed that the framework achieves its goal of integrating several gene expression patterns into a common template. This framework is ready to be used in order to construct a gene expression atlas integrating a large number of gene expression data of the zebrafish embryogenesis. In the near future, this atlas should be validated with known genetic interactions and used to unravel new ones, so that gene regulatory network models can become a reality. / Η διαδικαςία ανάπτυξης των εμβρύων καθορίζεται από τις συγχρονισμένες εκφράσεις ορισμένων γονιδίων. Το πώς αυτές ελέγχουν την δημιουργία ενός πολυκύτταρου οργανισμού από ένα κύτταρο αποτελεί αντικείμενο μελέτης της Αναπτυξιακής Βιολογίας. Ένας χάρτης γονιδιακής έκφρασης θα μπορούσε να συνδυάζει χρονικές, χωρικές και ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με την έκφραση των γονιδίων που ενορχηστρώνουν την διαδικασία ανάπτυξης ενός εμβρύου. Σε έναν τέτοιον χάρτη η γενετική δραστηριότητα θα αναλυόταν σε συνιστώσες που αφορούν το ποια, πότε, πού και πόσο εκφράζονται τα γονίδια σε κυτταρικό επίπεδο. Η ύπαρξη τέτοιων χαρτών για οργανισμούς, όπως το ζεβρόψαρο, που πρωταγωνιστεί σε μελέτες που αφορούν σπονδυλωτά, θα διευκολύνει την ταυτόχρονη μελέτη των εκφράσεων και των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων. Η παρούσα διπλωματική εστιάζεται στον σχεδιασμό και στην υλοποίηση μιας διαδικασίας επεξεργασίας εικόνας που θα είναι ικανή να συγκεντρώσει τις γονιδιακές εκφράσεις ενός συγκεκριμένου σταδίου ανάπτυξης του ζεβρόψαρου σε έναν τρισδιάστατο άτλαντα. Τα δεδομένα που πρέπει να επεξεργαστεί είναι τρισδιάστατες απεικονίσεις διαφορετικών εμβρύων, κάθε ένα από τα οποία έχει σημανθεί με φθορίζουσες ουσίες με στόχους το DNA των πυρήνων και τις εκφράσεις δύο γονιδίων, εκ των οποίων η μία είναι κοινή για όλα τα έμβρυα. Η πληροφορία που αποκαλύπτει κάθε ουσία βρίσκεται σε διαφορετικό κανάλι της κάθε εικόνας. Συνεπώς η διαδικασία θα πρέπει να συνδυάζει κατάλληλα τις πληροφορίες των διαφορετικών καναλιών και να ευθυγραμμίζει τρισδιάστατες εικόνες. Η υλοποιημένη διαδικασία δέχεται σειρές δεδομένων από δύο έμβρυα. Η μία απεικονίζει πλήρως ένα έμβρυο, το οποίο αποτελεί το έμβρυο αναφοράς και η άλλη μέρος του άλλου εμβρύου, το οποίο κα πρέπει να ευθυγραμμιστεί με το πρώτο. Η διαδικασία αποτελείται από διάφορα βήματα, τα οποία προεπεξεργάζονται τα δεδομένα, μετασχηματίζουν την εικόνα του μερικώς απεικονιζόμενου εμβρύου ώστε να αποκτήσει μια κατάλληλη αρχική θέση στον χώρο που ορίζεται από την εικόνα του ολόκληρου εμβρύου και τέλος ευθυγραμμίζουν την πρώτη εικόνα στην δεύτερη χρησιμοποιώντας ως αναφορά τη γονιδιακή έκφραση που είναι κοινή για όλα τα σημασμένα έμβρυα. Οι παράμετροι που προκύπτουν από την ευθυγράμμιση χρησιμοποιούνται για την αντιστοίχιση των άλλων σημασμένων γονιδιακών εκφράσεων, δημιουργώντας έτσι ένα τρισδιάστατο χάρτη εκφράσεων. Η υλοποίηση βασίστηκε στο Insight Segmentation and Registration Toolkit. Η διαδικασία δοκιμάστηκε με δεδομένα από έξι έμβρυα του ίδιου σταδίου ανάπτυξης και συγκρίθηκαν οι επιδόσεις τεσσάρων μεθόδων αντιστοίχισης. Οπτική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων ανέδειξε τον συνδυασμό της συνάρτησης του συντελεστή συσχέτισης με τον αλγόριθμο βελτιστοποίησης gradient descent ως την πιο κατάλληλη μέθοδο για την συγκεκριμένη εφαρμογή. Τα τελικά αποτελέσματα απέδειξαν ότι η διαδικασία επιτυγχάνει τον στόχο της. Η διαδικασία που υλοποιήθηκε στην παρούσα διπλωματική είναι έτοιμη προς χρήση για την δημιουργία ενός χάρτη γονιδιακής έκφρασης του ζεβρόψαρου. Αντικείμενο μελλοντικής μελέτης αποτελεί η επικύρωση του χάρτη με ήδη γνωστές γονιδιακές αλληλεπιδράσεις και κατόπιν η χρήση του για την εύρεση νέων.