Orientador: Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:56:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coeli_FernandaBorchers_D.pdf: 7777269 bytes, checksum: 053a66d2bc3df6ad0d5de7c2038f3246 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A hiperplasia congênita da adrenal é causada pela deficiência de uma das cinco enzimas responsáveis pela síntese do cortisol na esteroidogênese, sendo que mais de 90% dos casos ocorrem devido à deficiência de 21-hidroxilase (21-OH). O genoma haplóide humano possui duas cópias em tandem do gene que codifica para a 21-OH, denominados CYP21A2 e o CYP21A1P. Embora as duas cópias, CYP21A1P e CYP21A2, tenham aproximadamente 98% de homologia, CYP21A1P é classificado como um pseudogene, devido a algumas alterações deletérias em sua seqüência. Foram mapeados no braço curto do cromossomo 6, assim como os genes RP, C4 e TNX também duplicados em tandem. Este loco é denominado modulo RCCX, onde cada letra representa um gene. Uma conseqüência esperada deste tipo de organização é que esta favorece eventos de crossingover desigual, produzindo cromátides irmãs assimétricas e pares de gametas com um número variável de unidades completas. O crossover desigual não gera somente um tipo definido de deleção (alelos monomodulares), de duplicação (alelo trimodular) ou de conversão (alelo bimodular), mas pode, dependendo da sua exata localização, produzir um grande número de alelos diferentes, com significados funcionais variáveis. O objetivo deste trabalho foi investigar a variabilidade dos genes híbridos CYP21A21P/CYP21A2 quanto à região de recombinação nos alelos monomodulares, bimodulares e trimodulares de indivíduos com deficiência de 21- hidroxilase. Foram incluídos 55 pacientes com deficiência de 21 - hidroxilase, que foram avaliados por Southern blot, Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), PCR - Alelo especifico (ASO-PCR) e seqüenciamento. Na triagem por Southern blot foram identificados 26 alelos mono-, 26 bi- e 5 trimodulares com prováveis genes híbridos. Foi identificado um alelo monomodular novo portador da variante C4A [6,4 kb] que se mostrou único inclusive quanto à formação híbrida CYP21A21P/CYP21A2. Com a técnica de MLPA foi possível mapear três regiões principais de recombinação dos genes híbridos CYP21A21P/CYP21A2 nas três configurações alélicas. Além disso, foram identificados possíveis híbridos dos genes C4A e B, tanto nas configurações mono quanto nas bimodulares. Assim, ficaram definidos 5 haplótipos monomodulares, 7 bimodulares e 3 trimodulares. As técnicas de ASO-PCR e sequenciamento para análise dos híbridos CYP21A21P/CYP21A2 e dos CYP21A21P nos alelos bi e trimodulares refinaram a caracterização subdividindo estes haplótipos em 10 mono, 15 bi e 5 trimodulares. Dado o alto grau de variabilidade encontrado não foi possível se identificar efeito fundador de nenhum haplótipo específico para a deficiência de 21-hidroxilase. Por outro lado, um haplótipo novo correspondendo a cerca de 15% dos monomodulares foi caracterizado como portador das mutações p.P34L e p.H62L e um haplótipo igualmente não descrito portador da p.H62L foi encontrado entre os bimodulares. SNPs no terminal 5'UTR, no íntron 2 e no éxon 7 responderam pela diferenciação principal entre os híbridos tanto nos haplótipos de mesmo grupo como na comparação entre os de grupos diferentes. Este trabalho indica que a combinação de quatro técnicas e o estudo de segregação nas famílias foram fundamentais para o esclarecimento dos genótipos dos pacientes. Os genes híbridos podem estar relacionados às formas clínicas perdedora de sal, não perdedora de sal e não clássica dependendo da região onde ocorre a recombinação para sua formação. / Abstract: Congenital adrenal hyperplasia is caused by deficiency of one of the five enzymes responsible for cortisol synthesis in the steroidogenesis. More than 90% of the cases occur due to deficiency of 21-hidroxilase (21-OH). The haploid human genome bears two copies in tandem of 21-OH coding gene, CYP21A2 and CYP21A1P. Although the two copies are approximately 98% homologous, CYP21A1P is a pseudogene, due to some deleterious mutations. They map to the short arm of chromosome 6, as well as RP, C4 and TNX genes which are also duplicated in tandem. This locus is called RCCX module, each letter representing one gene. An expected consequence of such organization is that it favors events of unequal crossing-overs, producing pairs of gametes with different number of complete units. The aim of this investigation was to estimate the variability of CYP21A21P/CYP21A2 chimeric genes based on the region of recombination in the monomodular, bimodular and trimodular alleles in patients with 21-hydroxylase deficiency. Fifty-five patients were included for Southern blot, Multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA), Allele-specific PCR (ASO-PCR) and sequencing analyses. Southern blot identified alleles which were: mono (n = 26), bi (n = 26) and trimodular (n = 5) with chimeric genes. A novel monomodular allele was identified that carry C4A [6,4 kb] variant and also bore an unique CYP21A21P/CYP21A2 formation. MLPA technique mapped three main recombination regions in CYP21A21P/CYP21A2 chimerical genes in the three RCCX configurations. Moreover, it indicated possible chimeric C4A and B genes in both mono- and bimodular configurations. Therefore, five mono-, seven bi- and three trimodular haplotypes had been defined. Both ASO-PCR and sequencing techniques for CYP21A21P/CYP21A2 and CYP21A21P analysis had refined the characterization subdividing these haplotypes in ten mono-, fifteen bi- and five trimodular. Considering the high degree of variability observed it was not possible to identify a founder effect of any specific haplotype for the deficiency of 21-hidroxilase. Conversely, a novel haplotype corresponding to about 15% of the monomodular alleles was characterized as carrying the mutations p.P34L and p.H62L and, similarly one haplotype carrying the p.H62L was found among bimodular alleles. SNPs in the 5 ' UTR, intron 2 and exon 7 were responsible for the main differentiation among chimerical genes within a group as well as upon comparison between different groups. The results presented here indicate that the combination of four different techniques and the study of segregation in the families had been essential for defining the genotypes of the patients. It is also shown that CYP21A21P/CYP21A2 chimeric genes can be related to different clinical forms: salt losing, non-salt losing and non-classical depending on the region where the recombination for its formation occurs. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular