Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2013. / Submitted by Gomes Neide (neide@bce.unb.br) on 2014-06-13T16:17:18Z No. of bitstreams: 1 2013_BrianaCardosoFerreira.pdf: 3823657 bytes, checksum: 0dba96a4e2bbdef76dfc900053cfd1ba (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-06-18T11:52:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_BrianaCardosoFerreira.pdf: 3823657 bytes, checksum: 0dba96a4e2bbdef76dfc900053cfd1ba (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-18T11:52:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_BrianaCardosoFerreira.pdf: 3823657 bytes, checksum: 0dba96a4e2bbdef76dfc900053cfd1ba (MD5) / Os baculovírus são patogênicos a insetos e têm sido efetivos no controle de pragas em áreas agrícolas e florestais. No Brasil, o baculovírus anticarsia (AgMNPV) tem sido empregado como inseticida biológico desde o início da década de oitenta para o controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, uma das principais pragas dessa cultura. A principal rota de infecção do vírus se dá através da ingestão dos corpos de oclusão (OB) que, uma vez no intestino médio altamente alcalino, libera as partículas ODV (Occluded Derived Virus). A ligação, fusão e entrada dessas partículas nas células intestinais são mediadas por proteínas virais localizadas na membrana do ODV. Essas proteínas são codificadas por genes denominados pif (per os infectivity factors) os quais são fatores essenciais para infectividade oral, com consequente desenvolvimento da doença no corpo do inseto. Esse trabalho teve como objetivos: avaliar a estabilidade dos genes pif de isolados temporais e geográficos de AgMNPV; construir antissoros policlonais das proteínas PIF; construir vírus recombinantes com deleção de genes pif e analisar as sequências genômicas de dois clones de AgMNPV com grande diferença na virulência. Entre os genes pif dos isolados analisados, o gene pif2 apresentou ser o mais variável, possuindo maior número de sítios polimórficos entre os genes pif analisados. No entanto, a quantidade de SNP (Single Nucleotide Polymorphism) encontrada não indica alta variabilidade deste gene quando comparado a estudos semelhantes realizados com outros baculovírus. Este estudo revelou que apesar do vírus AgMNPV ter sido submetido a passagens subsequentes no inseto ao longo de 20 anos e da distância geográfica, os genes essenciais para a infectividade oral permaneceram estáveis. No estudo das proteínas PIF, somente a proteína PIF2 foi expressa, porém o anticorpo obtido não foi específico. Embora plasmídeos para deleção de genes pif tenham sido construídos, não foi possível a obtenção de vírus recombinantes. Os genomas dos clones virais analisados mostraram, entre outras características, a presença de uma única cópia dos genes pe38 e he65, que estão em duplicata no genoma do vírus AgMNPV-2D. Foi observado também que um dos clones virais (AgMNPV-16), com baixa virulência, possui muitas variações na região codificante do gene ie-2 e do gene pe-38. Esses genes são responsáveis pela transativação dos genes early que iniciam a replicação viral. Além disso, outros genes apresentaram alterações como odv-e56, que tem um papel essencial na maturação e envelopamento dos ODV, e os genes bro-a e bro-b que se encontram fundidos em uma única ORF. O número regiões hr também foi diferente entre os clones (Ag2D com nove, Ag-01 com oito e Ag-16 com sete hr). Os estudos de genes de infectividade oral e de fatores associados à virulência no hospedeiro são importantes para compreensão da dinâmica populacional do vírus em condições naturais e poder ser uteis no desenvolvimento de programas de controle biológico. / Baculoviruses are pathogenic to insects and have been effective in controlling pests in agricultural and forestry areas. In Brazil, the baculovirus anticarsia (AgMNPV) has been used as a biological insecticide since the early eighties to control the soybean caterpillar, Anticarsia gemmatalis, a major pest of this crop. The main route of virus infection occurs through ingestion of occlusion bodies (OB) which once in the highly alkaline midgut, release ODV (Occluded Derived Virus) particles. The binding, fusion and entry of such particles into the intestinal cells are mediated by viral proteins located in the membrane of the ODV. These proteins are encoded by genes called pif (per os infectivity factors) which are essential for oral infectivity, with consequent development of the disease in the body of the insect. This study aimed to evaluate the stability of the pif genes of seasonal and geographic field isolates of AgMNPV; to express PIF proteins for construction of polyclonal antibodies; to construct recombinant viruses with deleted pif genes, and to analyze the genomic sequence of two AgMNPV clones with high difference on their virulence. Among the pif genes of the analyzed isolates the pif2 gene was the most variable among the genes studied, showing a higher number of polymorphic sites. However, the amount of SNP (Single Nucleotide Polymorphism) found does not indicate a high variability of this gene when compared to similar studies performed with other baculovirus. This study revealed that although the AgMNPV virus has been subjected to subsequent passages in insect for over 20 years and the geographic distance, the essential genes for oral infectivity remained stable. In the study of PIF proteins, only the PIF2 protein was expressed, but the obtained antibody was not specific. Although plasmids for pif gene deletion were constructed, the recombinant viruses with pif genes deletion have not been completed. The genomes of the viral clones analyzed showed the presence of a single copy of the pe38 and he65 genes which are in duplicate in the genome of the Ag-2D clone. Was observed that one of the viral clones (Ag-16), with lower virulence, has many variations in the ie-2 and pe-38 gene regions, which are responsible to transactivate early genes to start viral replication. Furthermore, other genes presented alterations like the odv-e56, and which have a essential role in the maturation and envelopment of the OD, and bro-a and bro-b genes that are in fused in only one ORF. The hr region number was also different among clones (Ag-2D with nine, Ag-01 with eight and Ag-16 with seven hrs). Studies on the per os infectivity factors genes and factors associated with virulence of the host are important to the understanding of the viral population dynamics in natural conditions and can be valuable in the development of biological control programs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-05T20:14:13Z No. of bitstreams: 1 2008_BrianaCardosoFerreira.pdf: 1726853 bytes, checksum: 79af1e6efd638a8c867fcfa532c05c27 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-08T11:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_BrianaCardosoFerreira.pdf: 1726853 bytes, checksum: 79af1e6efd638a8c867fcfa532c05c27 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-08T11:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_BrianaCardosoFerreira.pdf: 1726853 bytes, checksum: 79af1e6efd638a8c867fcfa532c05c27 (MD5) Previous issue date: 2008-07-28 / Os baculovirus são vírus patogênicos a insetos, principalmente aos da ordem Lepidoptera. É comum o aparecimento de mutantes defectivos em populações de campo, com ausência de genes essenciais, que são mantidos pela co-infecção de células por diferentes genótipos virais. Esses genótipos quando purificados podem perder a capacidade de infectar a larva hospedeira, devido a deleções em genes pif (per os infectivity factor), essenciais para a infecção por via oral. Sabe-se que as proteínas PIF estão associadas ao envelope da partícula ODV, necessária para o estabelecimento da infecção primária no inseto. O genoma do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) foi recentemente seqüenciado sendo então relatada a presença dos genes pif-1 e pif-2 no vírus. Neste trabalho, genótipos de AgMNPV derivados do isolado de campo AgMNPV-79 foram selecionados e, através de análise de perfil de restrição do DNA viral, foi confirmada a existência de variantes genotípicos na população. Para a investigação da possível presença de mutantes defectivos, amplificações das regiões de pif-1 e pif-2 por PCR foram realizadas em cada variante sendo que todos os clones da população apresentaram amplificações dos dois genes. Todos os clones mostraram-se altamente infecciosos por ingestão oral, porém o genótipo Ag79-01 apresentou maior virulência entre eles. A presença de um terceiro gene pif (pif-3) foi identificada recentemente no genoma do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Da mesma forma, esse gene é também essencial para o estabelecimento da infecção primária por via oral. Por análise de BLAST o gene foi então identificado como a ORF 114 do genoma do vírus AgMNPV, a qual apresentou uma identidade de aminoácidos de 67% com a ORF do vírus AcMNPV. Com base nessa informação, primers para o gene pif-3 foram desenhados e amostras de DNA dos diferentes genótipos virais foram submetidas a amplificações por PCR. Novamente todos os clones virais apresentaram amplificação de um fragmento correspondente à região de pif-3. Uma vez que os genes pif estavam presentes em todos os variantes genotípicos analisados, foi elaborada uma estratégia para a construção de um vírus recombinante com deleção do gene pif-1, visando o estudo de seu papel na infecção oral do inseto. O vírus recombinante vAgGFP?pif-1, obtido por recombinação homóloga, teve o gene pif-1 substituído por um cassete gênico contendo um gene repórter (gfp) sob comando do promotor constitutivo hsp70. Esse vírus foi selecionado a partir da visualização de células infectadas emitindo fluorescência, devido à expressão da proteína GFP. O vírus vAgGFP?pif-1 encontra-se sob processo de purificação.