Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-05-04Bitstream added on 2014-06-13T20:30:10Z : No. of bitstreams: 1 camargo_la_me_arafcf.pdf: 458749 bytes, checksum: e566ad21072ed4474151776ec23f5806 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A presente dissertação permitiu quantificar a presença de glicerol-3-fosfato oxidase (GPO, sn-glicerol-3-fosfato: oxigênio 2-oxidorredutase, EC 1.1.3.21) em extratos de levedura seca de panificação por dois métodos: polarográfico e colorimétrico. A melhor metodologia de purificação da GPO foi obtida por rompimento celular com esferas de vidro, em homogenizador do tipo Bead Beater (Biospec products, USA), por 15 minutos, com 27,6% de eficiência de lise celular. O extrato celular bruto foi tratado com 1% de sulfato de estreptomicina antes da precipitação com igual volume de solução 30% (p/v) de polietilenoglicol 3350, dialisado e a sua atividade otimizada por método colorimétrico. A determinação das características da GPO foi possível em ensaios contendo: 250 mM de glicerol-3-fosfato em tampão 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 contendo 0,1% Triton X-100; 0,0133% de 4-aminoantipirina; 0,0266% de fenol; cerca de 0,40 unidade de peroxidase (PO) e água destilada para completar o volume de ensaio. A reação foi iniciada pela adição de 15 æL de extrato enzimático diluído 10 vezes seguido de uma incubação de 2 horas a 60°C e interrompida pela adição de solução 10% de SDS e a coloração desenvolvida foi medida a 500 nm. A GPO apresentou alta estabilidade térmica, pH de estabilidade entre 7,0 - 8,0 e a presença de azida de sódio na concentração de 0,05% manteve a atividade da enzima por 21 dias a 40°C. Este método permitiu também quantificar glicerol-3- fosfato, importante metabólito intermediário da biossíntese lipídica e glicolítica, na faixa de 56 - 250 mM. / The present dissertation allowed to quantify the presence of glycerol-3- phosphate oxidase (GPO, sn-glycerol-3-phosphate: oxygen 2-oxidoreductase, EC 1.1.3.21) in baker s yeast extract by two methods: polarographic and colorimetric. The best methodology of purification of GPO was obtained by cell debris with glass beads, in a Bead Beater homogenizator (Biospec products, USA), for 15 minutes, with 27.6% of efficiency of cellular lysis. The crude cellular extract was treated with 1% of streptomycin sulfate before the precipitation, with equal volume of a solution of 30% (w/v) polyethylene glycol 3350, dialysed and its activity was optimized by colorimetric method. The determination of the characteristics of GPO was possible in assays containing: 250 mM of glycerol-3-phosphate in 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 containing 0.1% Triton X-100; 0.0133% of 4-aminoantipyrine; 0.0266% of phenol; about 0.40 unit of peroxidase (PO) and water distilled to complete the volume. The reaction was started by the addition of 15 ìL of enzymatic extract diluted 10 times, followed by incubation of 2 hours at 60°C, interrupted by the addition of solution 10% of SDS, and the developed coloration was measured at 500 nm. GPO presented high thermal stability, pH of stability among 7.0 - 8.0, and the presence of sodium azide in the concentration of 0.05% maintained the activity of the enzyme for 21 days at 40°C. This method also allowed to quantify glicerol-3- phosphate, important intermediate metabolite of lipid biosynthesis and glycolysis, in the range 56 - 250 mM.

Resumo: A presente dissertação permitiu quantificar a presença de glicerol-3-fosfato oxidase (GPO, sn-glicerol-3-fosfato: oxigênio 2-oxidorredutase, EC 1.1.3.21) em extratos de levedura seca de panificação por dois métodos: polarográfico e colorimétrico. A melhor metodologia de purificação da GPO foi obtida por rompimento celular com esferas de vidro, em homogenizador do tipo Bead Beater (Biospec products, USA), por 15 minutos, com 27,6% de eficiência de lise celular. O extrato celular bruto foi tratado com 1% de sulfato de estreptomicina antes da precipitação com igual volume de solução 30% (p/v) de polietilenoglicol 3350, dialisado e a sua atividade otimizada por método colorimétrico. A determinação das características da GPO foi possível em ensaios contendo: 250 mM de glicerol-3-fosfato em tampão 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 contendo 0,1% Triton X-100; 0,0133% de 4-aminoantipirina; 0,0266% de fenol; cerca de 0,40 unidade de peroxidase (PO) e água destilada para completar o volume de ensaio. A reação foi iniciada pela adição de 15 æL de extrato enzimático diluído 10 vezes seguido de uma incubação de 2 horas a 60°C e interrompida pela adição de solução 10% de SDS e a coloração desenvolvida foi medida a 500 nm. A GPO apresentou alta estabilidade térmica, pH de estabilidade entre 7,0 - 8,0 e a presença de azida de sódio na concentração de 0,05% manteve a atividade da enzima por 21 dias a 40°C. Este método permitiu também quantificar glicerol-3- fosfato, importante metabólito intermediário da biossíntese lipídica e glicolítica, na faixa de 56 - 250 mM. / Abstract: The present dissertation allowed to quantify the presence of glycerol-3- phosphate oxidase (GPO, sn-glycerol-3-phosphate: oxygen 2-oxidoreductase, EC 1.1.3.21) in baker’s yeast extract by two methods: polarographic and colorimetric. The best methodology of purification of GPO was obtained by cell debris with glass beads, in a Bead Beater homogenizator (Biospec products, USA), for 15 minutes, with 27.6% of efficiency of cellular lysis. The crude cellular extract was treated with 1% of streptomycin sulfate before the precipitation, with equal volume of a solution of 30% (w/v) polyethylene glycol 3350, dialysed and its activity was optimized by colorimetric method. The determination of the characteristics of GPO was possible in assays containing: 250 mM of glycerol-3-phosphate in 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8.0 containing 0.1% Triton X-100; 0.0133% of 4-aminoantipyrine; 0.0266% of phenol; about 0.40 unit of peroxidase (PO) and water distilled to complete the volume. The reaction was started by the addition of 15 ìL of enzymatic extract diluted 10 times, followed by incubation of 2 hours at 60°C, interrupted by the addition of solution 10% of SDS, and the developed coloration was measured at 500 nm. GPO presented high thermal stability, pH of stability among 7.0 - 8.0, and the presence of sodium azide in the concentration of 0.05% maintained the activity of the enzyme for 21 days at 40°C. This method also allowed to quantify glicerol-3- phosphate, important intermediate metabolite of lipid biosynthesis and glycolysis, in the range 56 - 250 mM. / Orientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Coorientador: Maristela de Freitas Sanches Peres / Banca: Valdir Augusto Neves / Banca: Maria de Lourdes T. de Moraes Polizeli / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-18Bitstream added on 2014-06-13T18:50:48Z : No. of bitstreams: 1 silva_vc_me_arafcf.pdf: 335369 bytes, checksum: 08eedc270c2e51ba9d6a9688bf400044 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O gene GPD2 de Saccharomyces cerevisiae, que codifica a enzima glicerol-3- fosfato desidrogenase (G3PDH; EC 1.1.1.8; NAD+: oxidoredutase) foi clonado na levedura Pichia pastoris para expressar extracelularmente a enzima em meio de cultura. Essa enzima apresenta aplicação prática em diversos sistemas acoplados para determinação quantitativa de triacilglicerol, glicerol, ácido fosfatídico e outros fosfolipidios também podendo ser usada para medir atividades enzimáticas em diversos tipos de amostras. Para que a atividade extracelular fosse suficiente em ensaios industriais e biológicos, um estudo de indução da expressão da enzima foi realizado no presente trabalho, que consistiu em escolher o clone que melhor secreta a enzima e estudar o meio de crescimento (BMGY), a densidade inicial celular (0,05 mg/mL), o meio de indução enzimática (BMMY), a natureza do tampão (tampão fosfato), o pH (6,0), o tempo de produção da proteína (4 dias), a concentração da enzima através de membrana filtrante (120 vezes), a melhor fonte de peptona (Acumédia), o estudo de pré-indução celular por estresse osmótico (atividade de 0,477 ± 0,0 U/mL em 24 horas com NaCl 0,35M). O processo de produção da G3PDH mostrou que a máxima produtividade enzimática (795 U/mL e atividade específica de 44,49 U/mg) e biomassa final de 17,75 mg/mL foi obtida com as seguintes condições experimentais: 48 horas de indução com meio BMMY, utilizando 1% de metanol, 1% de glicerol, densidade inicial celular de 0,05 mg/mL, pH 5,0 e sobrenadante concentrado 120 vezes em membrana filtrante. / The GPD2 gene from Saccharomyces cerevisiae, which encodes the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH, EC 1.1.1.8, NAD +: oxidoredutase) was cloned in the yeast Pichia pastoris to express the enzyme extracellularly in the culture medium. The enzyme G3PDH has practical application in various systems coupled to quantitative determination of triacylglycerol, glycerol, phosphatidic acid and other phospholipids. It can also be used to measure the enzymatic activities in diverse types of samples. For the application of the enzyme extracellular in industrial and biological tests, a study of induction of expression of the enzyme was accomplished in the present work, that consisted of to choose of clone that more expressing the enzyme, the growth medium (BMGY), the cellular initial density (0.05 mg/mL), the medium of enzymatic induction (BMMY), the buffer nature (phosphate potassium), pH (6.0), the time of production of the protein (4 days), the concentration of the protein (120-fold), the peptone source (Acumédia), the study of pre-induction cellular for osmotic stress (activity of 0.477 ± 0.0 U/mL in 24 hours with NaCl 0.35M). The study of the variable determinative in the process of production of the G3PDH it showed that the maximum enzymatic productivity (0.795 U/mL and 44.49 U/mg of specific activity) and final biomass of 17.75 mg/mL was obtained with the following experimental conditions: 48 hours of induction with medium BMMY, using 1% methanol, 1% glycerol, cellular initial density of 0.05mg/mL, pH 5.0 and the supernatant concentrated 120-fold in filter menbrane.

Camundongos Swiss, quando submetidos à dieta hiperlipídica (HL), apresentam considerável ganho ponderal e de depósitos adiposos, tornando-se obesos e resistentes à insulina. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da dieta HL por 8 semanas no perfil inflamatório, síntese de triacilglicerol (TAG) com ênfase na vias de geração de glicerol-3-fosfato (G3P) e lipólise nos tecidos adiposos brancos (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. Camundongos Swiss foram alimentados com as dietas: controle (CT) - dieta purificada (AIN-93G); ou HL - dieta AIN-93G modificada contendo 35% de lipídeos (4% de óleo de soja e 31% de gordura suína). Os camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram uma maior massa corporal, acompanhada pelo aumento nos tecidos RETRO e EPI, além de desenvolverem resistência à insulina constatada no teste de tolerância à glicose (TTG), hiperglicemia e hiperinsulinemia. O conteúdo protéico da pAKT, avaliado por western blot (WB), e a adiponectina, dosada em homogenados dos tecidos adiposos, estão reduzidos apenas no EPI. Houve aumento na expressão gênica de MCP-1 e PAI-1, e foi observada menor área dos adipócitos no EPI, sem alteração no RETRO dos animais HL. A síntese de novo de ácidos graxos (AG), avaliada pela incorporação de 3H de 3H2O em AG foi maior em ambos os TAB, porém a captação de AG das lipoproteínas circulantes avaliada pela atividade e expressão da lipase lipoproteica (LPL) aumentou no EPI e reduziu no RETRO. A dieta HL induziu aumento na fosforilação do glicerol, avaliada pela atividade e conteúdo da GK que aumentaram nos dois TAB, e maior incorporação de 1-14C-glicerol em TAG no EPI. A captação de glicose in vitro e conteúdo do GLUT- 4, que indicam atividade da via glicolítica foram reduzidos no EPI e RETRO, assim como a gliceroneogênese avaliada pela incorporação de 1-14C-piruvato em TAG, sem alterações na atividade e conteúdo da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). A atividade lipolítica basal foi avaliada in vitro pela liberação de glicerol por adipócitos isolados, e não foi alterada pela ingestão de dieta HL, porém quando estimulada por noradrenalina a liberação de glicerol foi menor nos animais HL, assim como as fosforilações da ATGL e HSL e conteúdo do receptor adrenérgico ?3. A dieta HL levou a uma redução no conteúdo de PPAR? e aumento de ATF3 em ambos os tecidos. No EPI houve aumento de pCREB, pSTAT3 e RGS2 em relação aos controles enquanto no RETRO a única diferença encontrada foi a menor pSTAT3. Nossos resultados demonstram que o aumento nos TAB é resultado de maior síntese e captação de AG, e que o G3P necessário para a esterificação a TAG é proveniente principalmente da fosforilação direta do glicerol pela GK; além disso, a reduzida lipólise também parece contribuir para esse quadro. Nos animais HL, o EPI parece ser mais propenso aos efeitos da dieta do que o RETRO / Swiss mice when subjected to high fat diet (HFD), shown considerable weight gain and adipose depots, becoming obese and insulin resistant. The aim of this study was to evaluate the effect of HFD diet for 8 weeks in the inflammatory profile, triacylglycerol (TAG) synthesis with emphasis in glycerol-3-phosphate (G3P) generation pathways and lipolysis in retroperitoneal (RETRO) and epididymal (EPI) white adipose tissue (WAT) of mice. Swiss mice were fed with diets: control (CT) - purified diet (AIN-93G); or HFD - purified diet (AIN-93G) plus 35% of fat (4% soybean oil and 31% of lard). Mice fed a HFD diet had a higher body mass, accompanied by an increase in RETRO and EPI tissues, in addition to developing insulin resistance, evidenced by glucose tolerance test (GTT), hyperglycemia and hyperinsulinemia. The protein content of pAKT, accessed by western blot, and adiponectin, measured in WAT homogenates, are reduced only in EPI. There was an increase in gene expression of MCP-1 and PAI-1, and was observed smaller area of adipocytes in EPI, with no change in RETRO of HFD fed animals. De novo synthesis of fatty acids (FA), evaluated by incorporation of 3H from 3H2O in FA was higher in both TAB, but the uptake of FA, from blood lipoproteins, evaluated by the activity and expression of lipoprotein lipase (LPL) was increased in EPI and reduced in RETRO. HFD induced increase in phosphorylation of glycerol, evaluated by the activity and content of glycerolkinase (GyK) which increased in both TAB and greater incorporation of 1-14C-glycerol in the TAG only in EPI. The in vitro glucose uptake and GLUT-4 content, which indicates the activity of the glycolytic pathway were reduced in EPI and RETRO, as well as glyceroneogenesis assessed by the incorporation of 1-14C- pyruvate into TAG without changes in the activity and contents of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). The basal lipolytic activity was evaluated in vitro by glycerol releasing from isolated adipocytes, and was not altered by HFD intake, but when stimulated by noradrenaline glycerol release was lower in HFD animals as well as the phosphorylation of ATGL and HSL and ?3 adrenergic receptor content. HFD led to a reduction in the content of PPAR gamma and an increase in ATF3 in both tissues. In EPI there was an increase in pCREB, pSTAT3 and RGS2 while in RETRO the only difference was reduced pSTAT3. Our results shown that TAB increase is result of increased FA synthesis and uptake, and G3P required for esterification TAG comes mainly from direct phosphorylation of glycerol by GyK; Furthermore, reduced lipolysis also seems to contribute to this scenario. HFD effects seem to be more prominent in EPI than in RETRO

Camundongos Swiss, quando submetidos à dieta hiperlipídica (HL), apresentam considerável ganho ponderal e de depósitos adiposos, tornando-se obesos e resistentes à insulina. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da dieta HL por 8 semanas no perfil inflamatório, síntese de triacilglicerol (TAG) com ênfase na vias de geração de glicerol-3-fosfato (G3P) e lipólise nos tecidos adiposos brancos (TAB) retroperitoneal (RETRO) e epididimal (EPI) de camundongos. Camundongos Swiss foram alimentados com as dietas: controle (CT) - dieta purificada (AIN-93G); ou HL - dieta AIN-93G modificada contendo 35% de lipídeos (4% de óleo de soja e 31% de gordura suína). Os camundongos alimentados com a dieta HL apresentaram uma maior massa corporal, acompanhada pelo aumento nos tecidos RETRO e EPI, além de desenvolverem resistência à insulina constatada no teste de tolerância à glicose (TTG), hiperglicemia e hiperinsulinemia. O conteúdo protéico da pAKT, avaliado por western blot (WB), e a adiponectina, dosada em homogenados dos tecidos adiposos, estão reduzidos apenas no EPI. Houve aumento na expressão gênica de MCP-1 e PAI-1, e foi observada menor área dos adipócitos no EPI, sem alteração no RETRO dos animais HL. A síntese de novo de ácidos graxos (AG), avaliada pela incorporação de 3H de 3H2O em AG foi maior em ambos os TAB, porém a captação de AG das lipoproteínas circulantes avaliada pela atividade e expressão da lipase lipoproteica (LPL) aumentou no EPI e reduziu no RETRO. A dieta HL induziu aumento na fosforilação do glicerol, avaliada pela atividade e conteúdo da GK que aumentaram nos dois TAB, e maior incorporação de 1-14C-glicerol em TAG no EPI. A captação de glicose in vitro e conteúdo do GLUT- 4, que indicam atividade da via glicolítica foram reduzidos no EPI e RETRO, assim como a gliceroneogênese avaliada pela incorporação de 1-14C-piruvato em TAG, sem alterações na atividade e conteúdo da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). A atividade lipolítica basal foi avaliada in vitro pela liberação de glicerol por adipócitos isolados, e não foi alterada pela ingestão de dieta HL, porém quando estimulada por noradrenalina a liberação de glicerol foi menor nos animais HL, assim como as fosforilações da ATGL e HSL e conteúdo do receptor adrenérgico ?3. A dieta HL levou a uma redução no conteúdo de PPAR? e aumento de ATF3 em ambos os tecidos. No EPI houve aumento de pCREB, pSTAT3 e RGS2 em relação aos controles enquanto no RETRO a única diferença encontrada foi a menor pSTAT3. Nossos resultados demonstram que o aumento nos TAB é resultado de maior síntese e captação de AG, e que o G3P necessário para a esterificação a TAG é proveniente principalmente da fosforilação direta do glicerol pela GK; além disso, a reduzida lipólise também parece contribuir para esse quadro. Nos animais HL, o EPI parece ser mais propenso aos efeitos da dieta do que o RETRO / Swiss mice when subjected to high fat diet (HFD), shown considerable weight gain and adipose depots, becoming obese and insulin resistant. The aim of this study was to evaluate the effect of HFD diet for 8 weeks in the inflammatory profile, triacylglycerol (TAG) synthesis with emphasis in glycerol-3-phosphate (G3P) generation pathways and lipolysis in retroperitoneal (RETRO) and epididymal (EPI) white adipose tissue (WAT) of mice. Swiss mice were fed with diets: control (CT) - purified diet (AIN-93G); or HFD - purified diet (AIN-93G) plus 35% of fat (4% soybean oil and 31% of lard). Mice fed a HFD diet had a higher body mass, accompanied by an increase in RETRO and EPI tissues, in addition to developing insulin resistance, evidenced by glucose tolerance test (GTT), hyperglycemia and hyperinsulinemia. The protein content of pAKT, accessed by western blot, and adiponectin, measured in WAT homogenates, are reduced only in EPI. There was an increase in gene expression of MCP-1 and PAI-1, and was observed smaller area of adipocytes in EPI, with no change in RETRO of HFD fed animals. De novo synthesis of fatty acids (FA), evaluated by incorporation of 3H from 3H2O in FA was higher in both TAB, but the uptake of FA, from blood lipoproteins, evaluated by the activity and expression of lipoprotein lipase (LPL) was increased in EPI and reduced in RETRO. HFD induced increase in phosphorylation of glycerol, evaluated by the activity and content of glycerolkinase (GyK) which increased in both TAB and greater incorporation of 1-14C-glycerol in the TAG only in EPI. The in vitro glucose uptake and GLUT-4 content, which indicates the activity of the glycolytic pathway were reduced in EPI and RETRO, as well as glyceroneogenesis assessed by the incorporation of 1-14C- pyruvate into TAG without changes in the activity and contents of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK). The basal lipolytic activity was evaluated in vitro by glycerol releasing from isolated adipocytes, and was not altered by HFD intake, but when stimulated by noradrenaline glycerol release was lower in HFD animals as well as the phosphorylation of ATGL and HSL and ?3 adrenergic receptor content. HFD led to a reduction in the content of PPAR gamma and an increase in ATF3 in both tissues. In EPI there was an increase in pCREB, pSTAT3 and RGS2 while in RETRO the only difference was reduced pSTAT3. Our results shown that TAB increase is result of increased FA synthesis and uptake, and G3P required for esterification TAG comes mainly from direct phosphorylation of glycerol by GyK; Furthermore, reduced lipolysis also seems to contribute to this scenario. HFD effects seem to be more prominent in EPI than in RETRO