A dissertation submitted to the Faculty of Science, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfilment of requirements for the degree of Master of Science. Johannesburg, 2014. / The seemingly simple proton abstraction reactions underpin many chemical transformations including isomerization reactions and are thus of immense biological significance. Despite the energetic cost, enzyme-catalyzed proton abstraction reactions show remarkable rate enhancements. The pathways leading to these accelerated rates are numerous and on occasion partly enigmatic. The isomerization of the steroid, Δ5- androstene-3,17-dione by the human glutathione transferase A3-3 in mammals was investigated to gain insight into the mechanism. Particular emphasis was placed on the nature of the transition state, the intermediate suspected of aiding this process and the hydrogen bonds postulated to be the stabilizing forces of these transient species. Kinetics studies on Δ5-androstene-17-one, a substrate that is incapable of forming hydrogen bonds reveal that such stabilizing forces are not a requirement to explain the observed rate enhancements. The UV-Vis detection of the intermediate places this specie in the catalytic pathway while fluorescence spectroscopy is used to obtain the binding constant of the intermediate analogue equilenin. Analysis of the kinetics data in terms of the Marcus formalism indicates that the human glutathione transferase A3-3 lowers the intrinsic kinetic barrier by 3 kcal/mole. The results lead to the conclusion that this reaction proceeds through an enforced concerted mechanism in which the barrier to product formation is kinetically insignificant.

L'hexanitrohexaazaisowurtzitane ou CL-20 est un nouveau composé énergétique présentement à l'étude pour fin d'utilisation militaire. Le RDX (hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine) et le HMX (octahydro-1,3,5,7-tétranitro-1,3,5,7-tétrazocine) sont des contaminants couramment retrouvés dans le sol des sites militaires. La toxicité de ces deux derniers nitramines sur les espèces de vertébrés terrestres, tel que les mammifères, les amphibiens et les oiseaux, est de plus en plus documentée. Le CL-20 est un nitramine polycyclique caractérisé par des liens N-NO₂, ce qui est comparable au RDX et au HMX qui sont deux composés nitramines monocycliques. Étant donné leurs structures chimiques similaires, nous avons émis l'hypothèse que les effets du CL-20 sur les oiseaux seraient aussi semblables à ceux du RDX. Au cours de la présente étude, nous avons évalué les effets toxiques du CL-20 sur un gallinacé, la caille japonaise (Coturnix coturnix japonica) exposée à des doses journalières et répétées de CL-20. En premier lieu, un test sub-aigu de 14 jours a été réalisé, durant lequel les oiseaux ont subi des gavages répétés pendant les premiers 5 jours suivis de 10 jours sans exposition au CL-20 (diluant seulement). Dans un deuxième temps, un test nutritionnel sub-chronique a été réalisé sur une période de 42 jours. Au cours de ces deux études, aucun effet toxique n'a été observé chez les oiseaux exposés au CL-20. Par contre, une augmentation du poids du foie, des niveaux du sodium plasmique et de la créatinine ont été observés chez les oiseaux ayant reçu les doses de CL-20 les plus élevées. L'analyse du plasma et de certains organes vitaux des cailles (foie, cerveau, coeur et rate) a montré que le CL-20 n'était pas présent dans ces tissus, suggérant que le CL-20 pourrait être biotransformé in vivo. Au cours de l'étude nutritionnelle sub-chronique, le poids des embryons a significativement et proportionnellement diminué en fonction de la dose de CL-20. Les embryons des oiseaux exposés au CL-20 présentaient plusieurs malformations congénitales (autant crâniennes que faciales), telles que des courbures du bec, l'hypertrophie du cerveau moyen et le développement d'un seul côté du visage couplé à une micro-opthalmie (comparaison non statistique avec les embryons contrôles). Le nombre d'oeufs pondus par femelle tendait aussi à diminuer avec l'augmentation de la dose. Ces résultats suggèrent que le CL-20 aurait un effet sur le foie des femelles adultes. Le développement des embryons d'oiseaux diffère de celui du foetus de mammifères en ce sens que 90% de l'énergie requise par l'embryon d'oiseau provient de la β-oxydation des acides gras dérivés des lipides vitellins. Les lipides vitellins sont produits par le foie maternel et transmis aux oocytes en croissance, servant de source d'acides gras pour l'embryon. Ainsi, il est possible que les effets du CL-20 sur le foie maternel (via le métabolisme des acides gras et des composés xénobiotiques) conduisent à des effets nuisibles sur le développement de l'embryon qui est intimement lié au vitellus maternel. Notre hypothèse principale de travail est que le foie de caille pourrait contenir une ou des enzymes capable de biotransformer le CL-20. Nos résultats avec le cytosol total indiquent que la disparition du CL-20 est inhibée in vitro par l'acide éthacrynique ou un produit analogue au GSH, le s-octylglutathione, qui est une enzyme GST. La purification et la caractérisation de la glutathione S-transférase cytosolique (GST) a été effectuée à partir du foie de caille. L'analyse partielle de la séquence N-terminale a montré que les deux classes de GST alpha et mu de la caille ont une homologie de 100% avec la GST du poulet. Cette enzyme purifiée a pu bio transformer le CL-20 en présence de la glutathione (GSH), un co-facteur obligatoire. Nos résultats suggèrent que la protéine purifiée a bio transformé le CL-20, tel que mis en évidence par la formation concomitante de nitrite (NO₂) et la disparition du CL-20. Nos résultats suggèrent que la biotransformation du CL-20 par GST in vitro, pourrait expliquer la faible toxicité et l'absence de CL-20 in vivo. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Caille japonaise, CL-20, GST, acide éthacrynique.

L'expression élevée de la GSTP1 est fréquemment observée dans les cancers et est positivement corrélée à la résistance aux chimiothérapies. Cette enzyme de détoxication de phase II peut aussi réguler l'activité de protéines comme JNK et TRAF2 et, par conséquent, peut moduler les voies de prolifération et de mort cellulaire. Ce projet a donc consisté à étudier le rôle de la GSTP1 dans la prolifération des hépatocytes normaux ou transformés. L'étude de la régénération hépatique chez des souris Gstp1/2‐/‐ a permis de démontrer le rôle des protéines GSTP1 et GSTP2 dans le contrôle de la progression des hépatocytes normaux dans le cycle cellulaire. Après hépatectomie partielle chez les souris Gstp1/2‐/‐, une diminution importante du nombre d'hépatocytes dans les phases S, G2 et M est observée comparativement à des foies de souris contrôle. Cette réduction est associée à des retards d'expression de protéines impliquées dans l'initiation de la prolifération, le contrôle du point de restriction dépendant des mitogènes et dans la transition G1/S. Ces modifications sont associées à une réduction de l'expression de TRAF2 et de l'activation de JNK et ERK, alors que les taux de p21 et de p53 sont élevés. Parallèlement, un décalage dans l'expression d'enzymes qui régulent l'homéostasie redox et participent à l'activation des MAPK est observé. L'utilisation de cellules cancéreuses de différentes origines dont le foie, a également permis de corréler l'absence de GSTP1 à une diminution de prolifération cellulaire sans altération de la suivie cellulaire. Cependant dans ces conditions, nous observons une augmentation de l'expression de TRAF2, pJNK, pATF2, ATF3 associée à une induction de p21. Nous avons également montré que les effets de la GSTP1 sur la prolifération cellulaire sont régulés par l'activation de JNK. L'évidence du lien entre l'expression de la GSTP1 et la prolifération hépatocytaire nous a conduit à analyser l'expression d'enzymes de détoxication dans des carcinomes hépatocellulaires (CHC) et nous avons constaté une induction d'expression de GSTP1 dans le tissu péritumoral des CHC par rapport au foie normal. / Increased GSTP1 expression is frequently observed in cancers and is positively correlated with chemotherapy resistance. This phase II detoxifying enzyme can also regulate JNK and TRAF2 activities and, consequently, can modulate proliferation and cell death pathways. This project aimed at studying the role of GSTP1 during proliferation in normal and transformed hepatocytes. Liver regeneration study in Gstp1/2‐/‐ mice showed the involvement of GSTP1 and GSTP2 proteins in the cell cycle progression control of normal hepatocytes. After partial hepatectomy in Gstp1/2‐/‐ mice, the number of cells in S, G2 and M phases was decreased compared to livers of wildtype mice. This reduction is associated with the delay in the expression of proteins involved in proliferation initiation, mitogen restriction point control and G1/S transition. These modifications are associated with the decrease in TRAF2 expression and the activation of JNK and ERK, whereas p21 and p53 levels are high. Furthermore, expression of enzymes involved in redox homeostasis and MAPK activation is delayed. Study of cells derived from various cancers, including HCC, highlighted a correlation between low expression of GSTP1 and decrease in cell proliferation without cell survival alteration. However in these conditions, we observed the increase in TRAF2, pJNK, pATF2 and ATF3 expression together with the induction of p21. We also showed that GSTP1 effects are regulated by JNK activation. These results showed a link between GSTP1 expression and hepatocyte proliferation and led us to investigate the GSTP1 expression in HCC. We noticed an induction of GSTP1 expression in peritumoral tissue compared to normal liver.