Le développement des organismes multicellulaires, la morphologie de leurs organes, la formation de connections nerveuses ou même la réponse immunitaire conduisent à la formation de cellules dont la mort a été programmée, ces cellules sont en apoptose. Les corps apoptotiques générés sont éliminés par phagocytose, que l'on peut ainsi considérer comme l'étape ultime du programme apoptotique. Cette élimination, assurée soit par des phagocytes professionnels ou des cellules environnantes est très efficace et peu de cellules en apoptose sont observées dans les différents tissus et organes. Deux familles de protéines, ELMO et DOCK, sont connues pour être au centre d'une voie de signalisation impliquée dans l'activation de la petite GTPase Rac et le remodelage du cytosquelette d'actine permettant l'internalisation de corps apoptotiques, mais la manière dont ELMO est activée par la reconnaissance des corps apoptotique reste largement méconnue. Récemment, ELMO a été identifiée comme cible de la kinase hématopoïétique Hck. La phosphorylation d'ELMO constitue un signal d'activation de la voie de phagocytose. Nous avons pu montrer que les domaines N et C-terminaux d'ELMO sont impliqués dans l'interaction avec le domaine SH3 de Hck. Contrairement au SH3 de DOCK, l'interaction du domaine C-terminal avec le SH3 de Hck est strictement dépendante de la présence du polyproline. Les données obtenues sur les cellules transfectées suggère l'interaction in cellulo du motif polyproline avec le domaine SH3 de Hck. La différence dans le comportement du domaine C-terminal d'ELMO avec les deux SH3 nous a mené à identifier un complexe ternaire entre les trois protéines. Le motif polyproline d'ELMO est adjacent à l'une des 5 tyrosines phosphorylées par Hck, la tyrosine 720, nos résultats montrent que la phosphorylation de cette tyrosine défavorise l'interaction entre le domaine C-terminal et le SH3 de Hck. Cette phosphorylation pourrait être à l'origine d'un effet régulateur de Hck sur le complexe ELMO/DOCK. / Multicellular organisms development, tissue organization and morphogenesis, nerve connection network or even immune response lead to programmed cell death or apoptosis. Phagocytosis is the mean for the engulfment of the apoptotic corpses and can thus be considered as the final step of the apoptotic pathway. Both non-professional and professional phagocytic cells are implicated to achieve an efficient clearance of the apoptotic cells and debris, and very little dead cells are actually present in tissues under normal circumstances, preventing secondary necrosis and further inflammation. Two family of proteins, ELMO and DOCK have been identified as major characters in the signaling pathway leading to the activation of the small GTPase Rac, and actin remodeling, that eventually leads to engulfment. Nevertheless, very little is yet known about the upstream events leading to ELMO activation. Recently, ELMO has been characterized as a target for the hematopoietic cell kinase Hck, and consequent phosphorylation participates in ELMO activation. In the course of the present work, we demonstrated that both N- and C-terminal domains of ELMO are binding the SH3 domain of Hck. In contrast with the SH3 domain of DOCK, the SH3 domain of Hck binding to the C-terminal of ELMO is strictly dependent upon the polyproline motif. Our data obtained using transfected cells, further suggest the polyproline dependent interaction also occurs in cells. Taking into account the differential behavior of both SH3 domains from DOCK and Hck we next demonstrated a ternary complex formation between ELMO and both partners in vitro. Finally, we investigated the possible role for the Hck phosphorylation of Y720 located at the edge of the polyproline motif of ELMO and demonstrated that this phosphorylation clearly increases the Kd of ELMO/Hck interaction suggesting this phosphorylation could be part of a regulation loop in Hck dependent ELMO activation.

Primary immunodeficiencies (PID) are genetic disorders characterized by increased susceptibility to infections and various degrees of immune dysregulation. With the expansion of massive parallel sequencing, an increasing number of defects in immune-related genes is being identified in PID. However, the biological impact of the found mutations is often unknown. It is necessary to devise methods to clarify their causality for disease development, which may also aid therapeutic decisions. One of the novel discoveries are gain-of-function mutations in STAT1 gene, resulting in chronic mucocutaneous candidiasis. Candidiasis may be ameliorated with antimycotics or with targeted JAK-STAT inhibitor, ruxolitinib. For our patient with a novel mutation in STAT1, we developed a simple test for the detection of phospho-STAT molecules in peripheral blood lymphocytes. The test confirmed the gain-of-function character of the identified mutation and was used to monitor ruxolitinib treatment efficacy. In the second patient, who presented with lymphadenopathy and immunodeficiency, the as yet undescribed mutation in CASP8 was found. We proved its loss-of-function property expressed as reduced caspase-8 and caspase-3 cleavage, impaired cellular apoptosis, and decreased NFB-related signaling. The third patient who...

Primary immunodeficiencies (PID) are genetic disorders characterized by increased susceptibility to infections and various degrees of immune dysregulation. With the expansion of massive parallel sequencing, an increasing number of defects in immune-related genes is being identified in PID. However, the biological impact of the found mutations is often unknown. It is necessary to devise methods to clarify their causality for disease development, which may also aid therapeutic decisions. One of the novel discoveries are gain-of-function mutations in STAT1 gene, resulting in chronic mucocutaneous candidiasis. Candidiasis may be ameliorated with antimycotics or with targeted JAK-STAT inhibitor, ruxolitinib. For our patient with a novel mutation in STAT1, we developed a simple test for the detection of phospho-STAT molecules in peripheral blood lymphocytes. The test confirmed the gain-of-function character of the identified mutation and was used to monitor ruxolitinib treatment efficacy. In the second patient, who presented with lymphadenopathy and immunodeficiency, the as yet undescribed mutation in CASP8 was found. We proved its loss-of-function property expressed as reduced caspase-8 and caspase-3 cleavage, impaired cellular apoptosis, and decreased NFB-related signaling. The third patient who...

Le spermatozoïde doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, nommée capacitation, lui permettant ainsi d'acquérir son pouvoir fécondant. La phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques, observée durant la capacitation, fait partie des modifications que doit subir le spermatozoïde pour être en mesure de féconder l'ovule. Au cours des dernières années, plusieurs tyrosine kinases, les enzymes responsables de cette phosphorylation, ont été identifiées dans les spermatozoïdes de différents mammifères. Des études réalisées par l'utilisation d'inhibiteurs de ces enzymes ont démontré que les membres de la famille des src pouvaient être, en partie, responsables de l'élévation du contenu en phosphotyrosine lors de la capacitation. Il a donc été entrepris de détecter la présence des différents membres de cette famille dans les spermatozoïdes. Au cours de l'étude pour l'identification des tyrosine kinases de la famille des src dans le spermatozoïde, des isofolmes codant pour yes, lyn, lck et hck ont été identifiés. De plus, un isofonne tronqué de hck, nomlné hck-tr, a été identifié dans les cellules germinales haploïdes de taureau. Le but de ce projet de doctorat était donc de déterminer si la protéine hck et/ou son isoforme tronqué étaient impliqués dans la capacitation, réaction de l'acrosome et l'hyperactivité; processus menant à la fécondation. La première partie du projet avait pour objectif de confirmer la présence des ARNm encodant les isoformes de hck dans les cellules germinales et déterminer si la protéine correspondante était exprimée au niveau des spermatozoïdes matures. Les résultats obtenus ont permis de confirmer la présence des messagers identifiés et de montrer la présence, par l'utilisation d'anticorps spécifiques, des deux protéines dans les différentes cellules spermatogéniques. La caractérisation de ces isoformes a par la suite été entreprise permettant ainsi la localisation de hck -tr dans le testicule et le spermatozoïde bovin. La présence d'une forme active de la kinase pleine longueur a, quant à elle, été démontrée dans le testicule ainsi que dans les spermatozoïdes épididymaires et éjaculés. La dernière partie du projet consistait en la détermination des rôles potentiels que pouvaient avoir les isoformes de hck dans les événements menant à la fécondation. Hck-tr pourrait ainsi agir comme un inhibiteur puisque sa présence a provoqué une importante diminution de l'activité enzymatique de hck. Les résultats obtenus ont aussi permis d'identifier plusieurs protéines qui interagissaient spécifiquement avec hck, hck-tr ou les deux isoformes. Bien que certaines de ces protéines soient associées à des structures présentes dans la tête du spermatozoïde, la majorité des candidats identifiés sont retrouvés au niveau du flagelle. Cette étude permettra de mieux comprendre les implications de cette tyrosine kinase dans la phosphorylation en tyrosine observée durant la capacitation, la réaction de l'acrosome et l'hyperactivation du spermatozoïde