The onset of acute graft-versus host disease (aGVHD) is accompanied by macrophage priming and the presence of bacteria derived lipopolysaccharide (LPS) in the sera and organs of transplanted animals. Priming of macrophages occurs despite suppression of T cell function. We have investigated whether interleukin 12 (IL-12) mediates the continued production of interferon gamma (IFN-$ gamma$) during the state of T cell immunosuppression accompanying aGVHD. AGVHD was induced in non-irradiated AxC57BL/6 mice by an injection of C57BL/6 lymphoid cells. Despite T cell immunosuppression, macrophages remained primed as shown by their expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA and production of nitric oxide (NO) in response to exogenous LPS. Continued exposure to IFN-$ gamma$ was found to be required in order to maintain the primed state of macrophages during aGVHD; IFN-$ gamma$ mRNA within target organs of aGVHD including thymus, salivary gland, and lung was increased between day 7 and 14 after transplantation and was accompanied by the induction of the p40 peptide of IL-12 and iNOS mRNA. p40 peptide mRNA was also increased in macrophages purified on day 14 of aGVHD. These results provide evidence for localized production of IFN-$ gamma$ in aGVHD target organs and suggest that it is mediated by LPS induced IL-12 production by macrophages.

<p> The purpose of this dissertation was to evaluate changes in two antimicrobial markers, upper respiratory symptom (URS) variables, and mood state following participation in an acute (N = 93) and chronic (N = 88) observational study of college aerobic exercise, yoga exercise, and non-exercise classes. </p><p> <b>METHODS:</b> Unstimulated whole saliva was collected pre/post-acute (50 minutes) and pre/midpoint/post-chronic (12 weeks) during the study period. Saliva was analyzed for salivary immunoglobulin A (SIgA) and salivary alpha amylase (SAA) using protocols and assay kits by Salimetrics, upper respiratory symptoms (URS) were evaluated using the Wisconsin Upper Respiratory Symptom Survey (WURSS), and mood states were evaluated by the Profile of Mood States (POMS) questionnaire. </p><p> <b>RESULTS:</b> Analysis of the acute data revealed significant improvements for SIgA concentration in the aerobic exercise group (AEG) and the yoga exercise group (YEG) as well as SIgA secretion increases for all participants combined. No significant acute SAA concentration or secretion improvements were noted. </p><p> Chronic measurements revealed significant SIgA secretion (pretest to midpoint and pretest to posttest) and SFR increases (pretest to posttest) for all participants combined with no changes in SIgA concentration. The WURSS data revealed a significant decrease in the symptom score for the YEG and a significant increase in the symptom score for the non-exercise group (NEG) with notable but non-significant decreases in the incidence of infections of 39, 30, and 27 for the NEG, AEG, and YEG, respectively. Significant chronic SAA concentration decreases were noted for all participants combined between the pretest and posttest. Analysis of the POMS scores found significant acute improvements for all cohorts in all POMS categories and Total Mood Disturbance except for vigor-activity. Additionally, the entire cohort had significant chronic improvements for fatigue-inertia. </p><p> <b>CONCLUSIONS:</b> This study's results provide meaningful contributions to the field of mucosal immune research indicating that a 12 week yoga exercise class may decrease symptomatology of URS. The chronic SIgA secretion increases were attributed to SFR increases and the significant SFR increases may be a benefit for people suffering from xerostomia. Additionally, participation in an acute exercise session of aerobic or yoga exercise may elevate SIgA concentration immediately following exercise indicating strengthened mucosal immunity. </p><p> Since SAA is a relatively new antimicrobial marker, this study provides meaningful observations about the pattern of change seen in SAA following acute and chronic exercise of low and moderate intensity. </p><p> Collectively, these results provide support for the continued encouragement of individuals to use moderate and low intensity exercise such as aerobics and yoga to improve mucosal immunity.</p>

Recent studies have unveiled an anti-inflammatory property of the type 2 diabetes drug, metformin. This has been demonstrated by a decreased severity of endotoxin-induced uveitis in mice. Metformin is also shown to reduce airway remodeling and inflammation in murine models of chronic asthma. While the exact mechanism by which metformin exhibits these effects has yet to be elucidated, the biguanide drug appears to interfere with pro-inflammatory NFkB signaling. We wished to examine whether this phenomenon could be replicated in vivo in various mouse models involving both acute and chronic inflammation. The utility of metformin in inflammatory conditions such as sepsis, acute lung injury, hepatocellular carcinoma and colitis was explored. Our results suggest that metformin reduces disease severity in acute models of both sepsis and dextran sodium sulfate (DSS) colitis, as measured by serum cytokine levels and colon histology. In acute sepsis, metformin reduced TNFα serum levels (p<0.0001). Histologic scores of the colons of DSS-treated mice improved significantly with concurrent metformin administration (p=0.0013). These results pave the way for further investigation into the topic. Modifications to the other disease models used are required in order to make conclusive statements about metformin's potential effect. / Des études récentes ont dévoilé que la metformine, une drogue contre le diabète de type 2, a des propriétés anti-inflammatoires. Ceci a été démontré par une diminution de la sévérité de l'uvéite induite par une endotoxine chez la souris. Il a aussi été démontré que la metformine peut réduire le remodelage et l'inflammation des voies respiratoires dans des modèles murins de l'asthme chronique. Même si les mécanismes précis par lesquels la metformine exerce ces effets n'ont pas encore été élucidés, la drogue biguanide semble interférer dans la voie de signalisation de la protéine pro-inflammatoire NFκB. Nous avons voulu examiner si ce phénomène pouvait être reproduit in vivo dans des modèles de souris impliquant l'inflammation aiguë et chronique. L'utilité de la metformine a été explorée dans des conditions d'inflammation comme la septicémie, les lésions pulmonaires aiguës, le carcinome hépatocellulaire et la colite. Nos résultats suggèrent que la metformine réduit la sévérité de la maladie dans des modèles d'inflammation aiguë autant pour la colite septicémique que celle due au dextran de sulfate de sodium (DSS), ceci ayant été déterminé par une mesure des niveaux de cytokines dans le serum et par l'histologie du côlon. Dans la septicémie aiguë, la metformine réduit les niveaux de TNFα dans le serum (p<0.0001). Le score histologique du côlon des souris ayant reçu le DSS s'est amélioré d'une façon significative lorsque la metformine est administrée simultanément (p=0.0013). Ces résultats ouvrent la voie pour des investigations plus approfondies dans ce domaine. Des modifications aux autres modèles utilisés de la maladie sont requises pour déclarer de façon concluante que la metformine a un effet potentiel dans le traitement de l'inflammation.

Functional immunity requires a balanced T cell immune response, which entails the maintenance of de novo production (i.e. TCR repertoire diversity) and the appropriate differentiation of effector subsets at the periphery. However, numerous pathogenic changes can perturb this homeostasis. On the one hand, diminished thymopoiesis or exhausted effectors cause immune dysfunction, leading to the persistence of virally infected or cancerous cells. Unrestrained immune reaction, on the other hand, can cause significant tissue damage. The main objective of my thesis therefore was to develop novel therapeutics to modulate T cell immunity in the context of cancer and inflammatory diseases. Interleukin-7 (IL7) is critically involved in T cell development and homeostatic proliferation. In order to pharmacologically induce T cell neogenesis for immune reconstitution and cancer therapy, we developed a novel biopharmaceutical based on the fusion of GMCSF and IL7 (GIFT7). GIFT7 administration in aged mice led to cortical hyperplasia, effectively reversing tissue involution. GIFT7-mediated hypertrophic effect includes an increase in total thymic cellularity and more importantly a 4-fold increase in the number of CD4-CD8-CD44intCD25-early thymic precursors. In the periphery, GIFT7 selectively expand a CD8+subset from pre-activated T cells with a phenotype defined as CD8+CD44+CD62L+CCR7+KLRG-CD27+, hereafter TGIFT7. The adoptive transfer of OTI-derived CD8 TGIFT7 into OVA-EG7-bearing mice leads to significant tumor regression. Furthermore, the human ortholog of GIFT7 (hGIFT7) leads to a two-fold increase in total cell number after 3 days and >80% of Ki67+expression in both CD4+ and CD8+ PBMC with concurrent reduction in PD1 expression, the cardinal marker of T cell exhaustion. Therapeutically, augmented T cell immunity via GIFT7 delivery rescues mice from disseminated leukemia. On the opposite spectrum of hypofunction, self-directed T cell over-reaction also demands therapeutic intervention. We have previously shown N-terminal modified(tetra-peptide-cleaved) MCP3 possessed immune suppressive activity. In view of this, we hypothesized that a synthetic cytokine linking GMCSF to MCP3 (GMME3) as part of a single polypeptide would augment its immune plasticity. We demonstrated that GMME3 induces significant Ca++ influx, activating IL10+CD21hiCD24hi CD1.dhi subset of splenic B cells (BGMME3) capable of inhibiting antigen presentation and Th17. The adoptive transfer of BGMME3 to mice symptomatic with experimental autoimmune encephalitis attenuated disease progression. Overall, the research presented in this thesis supports the use of GMCSF-based fusion cytokine as novel immune regenerative and modulatory therapeutics to (i)augment thymopoiesis, (ii) promote effector expansion, (iii) and regulate helper polarization. Therefore, our work points to the translational potential of fusion cytokines or fusion-primed immune cells as treatment of T cell dysfunction. / L'immunité fonctionnelle des lymphocytes T exige le maintien de la diversité de répertoire et la différenciation appropriée des sous-ensembles à la périphérie. Cependant, les nombreux changements pathogènes peuvent perturber cette homéostasie. D'une part, la diminution de thymopoïèse ou l'épuisement des effecteurs provoquent un dysfonctionnement immunitaire, conduisant à la persistance des cellules infectées par des virus ou des cellules cancéreuses. Une réaction immunitaire effrénée peut, d'autre part, endommager les tissus. Le principal objectif de ma thèse était donc de développer de nouvelles thérapies pour moduler l'immunité des cellules T dans le contexte du cancer et des maladies inflammatoires. L'interleukine-7 (IL7) est particulièrement importante dans le développement des cellules T et sa prolifération homéostatique. Afin d'induire pharmacologiquement la néogenèse des cellules T, pour la reconstitution immunitaire et le traitement du cancer, nous avons développé un produit biopharmaceutique basé sur la fusion de GM-CSF et IL7 (GIFT7). L'administration de GIFT7 à des souris âgées a conduit à une hyperplasie corticale, inversant efficacement l'involution des tissus. L'effet hypertrophique du GIFT7 provoque une augmentation de la cellularité thymique totale et surtout une multiplication par 4 du nombre de CD4-CD8-CD44intCD25-précurseurs thymiques. Dans la périphérie, GIFT7 provoque la prolifération sélective d'un sous-ensemble CD8+ avec un phénotype défini comme CD8+CD44+CD62L+CCR7+KLRG-CD27+ (TGIFT7). Le transfert adoptif de cellules CD8 dérivée OTI-TGIFT7 dans l'OVA-EG7 des souris porteuses conduit à une régression tumorale significative. En outre, l'orthologue humain de GIFT7(hGIFT7) conduit à une multiplication par deux du nombre de cellules total après 3 jours et > 80% de Ki67+ expression dans les deux CD4+ et CD8+ PBMC avec réduction concomitante de PD1 expression, qui est le marqueur cardinal de l'épuisement des cellules T. L'augmentation de l'immunité des cellules T, via la livraison de GIFT 7, sauve les souris de leucémie diffusée. Sur le spectre opposé d'hypofonction, la sur-réaction de l'auto-cellule T exige également une intervention thérapeutique. Nous avons montré précédemment que le N-terminal modifié (tétra-peptide clivé) MCP3 possédait une activité immunitaire suppressive. Compte tenu de cela, nous avons émis l'hypothèse qu'une cytokine GM-CSF synthétique liée au MCP3 (GMME3) dans le cadre d'un polypeptide unique permettrait d'accroître sa plasticité immunitaire. Nous avons démontré que le GMME3 induit significativement Ca++ afflux, l'activation de l'IL10+CD21hiCD24hiCD1.dhi sous-ensemble de cellules B spléniques (BGMME3) capables d'inhiber la présentation de l'antigène et Th17. Le transfert adoptif de BGMME3 a atténué la progression de la maladie auto-immune de souris présentant des symptômes d'encéphalite expérimentale. Dans l'ensemble, la recherche présentée dans cette thèse soutient l'utilisation de la fusion pour la régénération immunitaire et de la thérapeutique modulation de (i) lathymopoïèse, (ii) l'expansion effecteur, (iii) et de la polarisation d' CD4+. Nos points de travail concernent le potentiel de translation de cytokines de fusion ou de fusion-apprêtées cellules immunitaires pour le traitement de la dysfonction des cellules T.

Innate immune recognition of microbial components by pattern recognition molecules (PRM) has been established as a critical step for the onset of immunity against invading pathogens. The nucleotide-binding oligomerization domain 1 (Nod1) protein of the PRM family of Nod-like receptors (NLR) has been shown to play an essential role in this early immune response by modulating the inflammatory response through recognition of specific bacterial peptidoglycan (PGN) structures. In addition to instructing recruitment of granulocytes and monocytes to the site of inflammation, we demonstrate here that Nod1-mediated PGN recognition also promotes rapid B cell accumulation in secondary lymphoid organs (SLO). Therefore, this thesis aimed at further understanding the mechanisms by which Nod1 modulates B cell localisation during infection-induced inflammation. We observed that Nod1 stimulation induces two waves of chemokine production: an early production of keratinocyte chemoattractant KC and the C-C chemokine CCL2, and a second wave of the C-X-C chemokine CXCL13 and CCL20 release that coincided with a decrease of mature follicular (MF) B cells in the blood and the bone marrow, as well as a rapid and transient increase in MF B cell numbers in SLO. Although Nod1 stimulation induces the release of several cytokines, we establish here that the observed B cell accumulation in SLO occurs independently of B cell proliferation and requires a functional TNFalpha-CCL20-CCR6 axis. These results reveal a novel mechanism for rapid mobilisation of B cells during inflammation, and shed light on how B cells participate in innate and adaptive immune responses to microbial stimulation. / La reconnaissance d'organismes microbiens par les récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRM : pattern recognition molecules) du système immunitaire inné représente une étape cruciale dans l'initiation de la réponse immunitaire. Le récepteur cytoplasmique Nod1 (nucleotide-binding oligomerisation domain 1) reconnaît spécifiquement le peptidoglycane bactérien et joue un rôle majeur dans la reconnaissance innée d'agents pathogènes et l'initiation de la réponse inflammatoire. En plus de promouvoir le recrutement de granulocytes et monocytes au site de l'inflammation, notre projet de recherche démontre que la stimulation de Nod1 promeut l'accumulation de lymphocytes B dans la rate et les ganglions lymphatiques. La présente thèse de recherche avait pour but premier de décrire et comprendre les mécanismes par lesquels le récepteur Nod1 influence la mobilité des cellules B durant une infection. Suite à l'activation de Nod1, nous avons observé deux vagues de production de chimiokines : la première contenait les chimiokines KC (keratinocyte chemoattractant) et CCL2, alors que la deuxième contenait les chimiokines CXCL13 et CCL20. Suite à la deuxième vague, nous avons observé une augmentation rapide et transitoire du nombre de cellules B dans la rate et les ganglions lymphatiques, conjointement à une diminution de cellules B dans le sang et la moelle osseuse. De plus, ces cellules B étaient principalement des lymphocytes B folliculaires. Malgré que l'activation du récepteur Nod1 induise la sécrétion de plusieurs cytokines, nous avons démontré que l'accumulation de cellules B n'est pas due à une augmentation de leur prolifération, mais bien à un recrutement de ces dernières par l'axe TNF alpha-CCL20-CCR6. Ce projet de recherche démontre donc un nouveau mécanisme pour la mobilisation rapide des cellules B durant une inflammation, et souligne l'importante participation des cellules B dans la réponse antimicrobienne.

PTP-PEST (protein tyrosine phosphatase - proline-, glutamic acid-, serine- and threonine-rich; also named PTPN12) is an intracellular protein tyrosine phosphatase highly expressed in non-immune and immune cells. PTP-PEST was previously reported to be a critical regulator of cytoskeletal reorganization, cell adhesion and migration in non-immune cells. Moreover, PTP-PEST has a role as tumor suppressor in several types of human solid tumors. Recently, the roles of PTP-PEST in immune cells have also been clarified, using a cell type-specific conditional PTP-PEST-deficient mouse. In T cells, PTP-PEST has an essential role in secondary T cell activation, inhibition of T cell anergy and induction of autoimmunity. The data presented in this thesis address the roles of PTP-PEST in innate immune cells, including macrophages and dendritic cells. Macrophages are innate immune cells that efficiently eliminate pathogens, tumor cells and cell debris, largely through phagocytosis and cytokine production. Under special conditions, they can also undergo cell-cell fusion to form multinucleated giant cells and osteoclasts, which have been implicated in elimination of pathogens or foreign bodies and bone resorption, respectively. Using a macrophage-targeted PTP-PEST-deficient mouse, I show that PTP-PEST is a critical positive regulator of macrophage fusion into multinucleated giant cells in response to interleukin-4 (IL-4). Using a macrophage cell line (RAW264.7), I provide evidence that PTP-PEST is also important for macrophage fusion into osteoclasts in response to RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand). Further studies indicate that the critical role of PTP-PEST in macrophage fusion is due to its involvement in the control of migration and adhesion of macrophages during the fusion process. This function correlates with the ability of PTP-PEST to regulate the extent of tyrosine phosphorylation of the protein tyrosine kinase, Pyk2, and the adaptor molecule, paxillin.Dendritic cells are the most efficient antigen-presenting cells in the body. They are able to capture and process antigens in peripheral tissues. Upon maturation in response to inflammatory stimuli, they then migrate to lymphoid tissues, where they are able to present processed antigens to antigen-specific T cells. This cascade enables initiation of T cell-dependent immune responses. Using a dendritic cell-targeted PTP-PEST-deficient mouse, I observe that PTP-PEST is crucial for the capacity of dendritic cells to initiate T cell-dependent immune responses and immune pathology in vivo. This function is due in part to a minor role of PTP-PEST in antigen capture, processing or both. More significantly, it is also caused by an essential role of PTP-PEST in dendritic cell migration from peripheral tissues to lymphoid tissues. As is the case for macrophages, this activity correlates with the aptitude of PTP-PEST to control tyrosine phosphorylation of Pyk2 and paxillin.Together, the new findings described in this thesis provide strong evidence that PTP-PEST mediates essential functions in innate immune cells. / PTP-PEST (protéine tyrosine phosphatase riche en proline, acide glutamique, sérine et thréonine; également connue sous le nom de PTPN12) est une protéine tyrosine phosphatase intracellulaire abondamment exprimée dans les cellules immunes et non immunes. Auparavant, PTP-PEST a été considéré comme un régulateur critique de la réorganisation du cytosquelette, l'adhésion cellulaire et la migration des cellules non immunes. De plus, PTP-PEST a un rôle en tant que suppresseur de tumeurs dans plusieurs types de tumeurs solides humaines. Récemment, les rôles de PTP-PEST dans les cellules immunes ont également été clarifiés en utilisant une souris ayant une déficience conditionnelle de PTP-PEST. Dans les cellules T, PTP-PEST joue un rôle essentiel dans l'activation des réponses secondaires, l'inhibition de l'anergie des cellules T et l'induction de l'auto-immunité. Les résultats présentés dans cette thèse portent sur les rôles de PTP-PEST dans les cellules du système immunitaire inné incluant les macrophages et les cellules dendritiques. Les macrophages sont des cellules du système immunitaire inné qui éliminent de façon efficace, principalement par phagocytose et production de cytokines, les pathogènes, les cellules tumorales et les débris cellulaires. Dans certaines conditions particulières, les macrophages peuvent former, par un processus de fusion intercellulaire, des cellules multinuclées géantes ou des ostéoclastes qui sont, respectivement, impliquées dans l'élimination des pathogènes ou des corps étrangers, et dans la résorption osseuse. À l'aide d'une souris ayant une déficience de PTP-PEST spécifique aux macrophages, nous avons démontré que PTP-PEST est un régulateur positif essentiel pour la formation de cellules multinuclées géantes par la fusion des macrophages en réponse à une stimulation par l'interleukine-4. En utilisant une lignée cellulaire de macrophages (RAW264.7), nous avons également mis en évidence que PTP-PEST est important pour la formation d'ostéoclastes par la fusion des macrophages en réponse à l'activateur RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B ligand). Des études plus poussées ont révélé que ce rôle essentiel de PTP-PEST dans la fusion des macrophages dépend de son implication dans le contrôle de la migration et de l'adhésion des macrophages pendant le processus de fusion. Cette fonction est en corrélation avec la capacité de PTP-PEST de contrôler le niveau de phosphorylation sur tyrosine de la protéine tyrosine kinase Pyk2 et de la molécule adaptatrice paxillin.Parmi les cellules présentatrices d'antigène dans le corps, les cellules dendritiques sont les plus efficaces. Elles sont capables de capter et de traiter des antigènes dans les tissus périphériques. Suite à leur maturation en réponse à des stimulations inflammatoires, elles migrent vers les tissus lymphoïdes où elles présentent des antigènes spécifiques aux cellules T appropriées. Cette suite d'événements permet de déclencher les réponses immunitaires dépendant des lymphocytes T. En utilisant une souris ayant une déficience de PTP-PEST spécifique aux cellules dendritiques, nous avons montré que PTP-PEST est crucial pour permettre aux cellules dendritiques d'initier ce type de réponse immunitaire ainsi qu'une pathologie immune in vivo. Cette fonction est due en partie au rôle mineur de PTP-PEST dans la capture ou le traitement des antigènes, ou les deux. Cependant, d'une manière plus significative, cette fonction découle du rôle essentiel de PTP-PEST dans la migration des cellules dendritiques des tissus périphériques vers les tissus lymphoïdes. Comme dans le cas des macrophages, cette activité est en corrélation avec la capacité de PTP-PEST de contrôler la phosphorylation sur tyrosine de Pyk2 et de paxillin.L'ensemble des nouvelles observations décrites dans cette thèse démontre clairement le rôle essentiel de PTP-PEST dans les cellules du système immunitaire inné.

The efficacy of bone marrow transplantation is critically dependent on the transfer of sufficient hematopoietic stem cells (HSCs) which possess the capacity for self-renewal and can fully reconstitute the hematopoietic system. By transiently manipulating the factors that govern HSC homeostasis it has been proposed that HSCs can be expanded without the loss of essential stem cell characteristics. Previously it was observed that ablation of Gfi1b in-vivo using the interferon based Mx-Cre system results in a dramatic expansion and mobilization of hematopoietic stem cells in the bone marrow and periphery. I was able to replicate this finding using a non-inflammatory, tamoxifen inducible, deletion system indicating this expansion is a property of Gfi1b ablation and so it was hypothesized that Gfi1b regulates the fate of HSCs and is a potential target for their ex-vivo expansion. Indeed, when deletion of Gfi1b was induced in whole bone marrow ex-vivo HSCs expanded both in absolute number and in terms of proportion of bone marrow by approximately 5-fold. Furthermore, in ex-vivo¬ expansion cultures of primary HSCs tracking of surface levels of cd48, which indicates an HSC has transitioned to a differentiation committed multi-potent progenitor, revealed that Gfi1b null HSCs underwent symmetric self-renewal type cell divisions at a significantly increased frequency. Importantly it has also been shown that HSCs lacking Gfi1b cycle at a faster rate than control HSCs. This combination of increased cell division and preferential self-renewal of Gfi1b-/- HSCs indicates that inhibition of Gfi1b is an ideal strategy for ex-vivo HSC expansion. As well, in accordance with this preference for self-renewal, Gfi1b null HSCs that were cultured under myeloid differentiation conditions remained primarily in an undifferentiated state as defined by a lack of the myeloid surface markers Gr1 and Mac1. These cultures also demonstrated increased long term colony forming capacity versus controls, further supporting an undifferentiated phenotype in Gfi1b-/- cells.Because the stem cell niche is a highly complex and heterogeneous environment I also investigated whether bone marrow in which Gfi1b has been deleted exerts paracrine effects that contributed to HSC expansion. Co-Culture assays demonstrated that Gfi1b-/- bone marrow was able to induce an expansion of progenitors in wild-type bone marrow of more than 10 fold compared to Gfi1b-/+ bone marrow. Interestingly cells co-cultured with Gfi1b null bone marrow also exhibited an overall proliferation advantage of approximately 3 fold after short-term cultures. This indicates that not only does loss of Gfi1b induce HSC expansion via cell intrinsic mechanisms, but also through paracrine factors that alter the bone marrow homeostasis. I also investigated the role of Gfi1b in HSC associated malignancies. Previously it had been described that Gfi1b is overexpressed in BCR-ABL driven CML and B-ALL. As well work from our lab showed that transgenic overexpression of Gfi1b in model B-ALL accelerate disease progression and morbidity. I was able to show that deletion of Gfi1b in an established B-ALL leads to remission of disease. As well pharmacological inhibition of the core Gfi1b co-factor LSD1 was shown to kill CML cells in-vitro proportionally to concentration. This suggests that Gfi1b plays a central functional role in both normal and malignant hematopoietic cells. / L'efficacité d'une greffe de moelle osseuse dépend de façon critique du transfert d'un nombre suffisant de cellules souches hématopoïétiques (CSHs) qui possèdent 1- la capacité de s'auto-renouveler et 2- la capacité d'entièrement reconstituer le système hématopoïétique suite à leur différentiation. En manipulant transitoirement les facteurs qui régissent l'homéostasie des CSHs, il a été proposé qu'une expansion de ces dernières peut être réalisée sans entraîner la perte de leurs caractéristiques essentielles. Il avait préalablement été observé que l'ablation de l'expression de Gfi1b in vivo, grâce au système Mx-Cre basé sur l'interféron, entraînait une expansion et une mobilisation spectaculaires du nombre de CSHs dans la moelle osseuse et la périphérie. J'ai pu reproduire ce résultat en utilisant un système de suppression de l'expression de Gfi1 inductible au tamoxifen et non-inflammatoire, suggérant que l'expansion du nombre de CSHs observée est bien une propriété de l'ablation de l'expression de Gfi1b. Nous avons par conséquent émis l'hypothèse que Gfi1b régie le sort des CSHs et est une cible potentielle pour leur expansion ex-vivo. En accord avec cette hypothèse, nous avons observé une expansion d'environ 5 fois du nombre de CSHs en nombre absolu et en termes de proportion de la moelle osseuse lorsque la délétion de l'expression de Gfi1b est induite dans l'ensemble des cellules de moelle osseuse ex-vivo. De plus, le suivi des niveaux d'expression dans les cultures d'expansion de CSHs du marqueur de surface CD48, qui indique qu'une CSH s'est différentiée en progéniteur multipotent, a permis de révéler que les CSHs Gfi1b-nulles se sont divisées de façon symétrique en conservant leur capacité d'auto-renouvellement avec une fréquence significativement plus élevée que les cellules contrôles. Il a également été démontré que les CSHs Gfi1b-nulle se divisent à un rythme plus élevé. Cette combinaison de l'augmentation de la division cellulaire et de l'auto-renouvellement des CSHs Gfi1b-/- indique que l'inhibition de Gfi1b est une stratégie idéale pour l'expansion des CSHs ex-vivo. Conformément à cette préférence pour l'auto-renouvellement, les CSHs Gfib-nulles qui ont été cultivées dans des conditions de différenciation myéloïde sont restées principalement dans un état indifférencié tel que défini par l'absence de marqueurs de surface myéloïdes Gr1 et MAC1. Ces cultures ont également démontré une augmentation de leur capacité à former des colonies à long terme en comparaison des contrôles. Ces résultats soutiennent le phénotype non différencié des cellules Gfi1b-/-. J'ai également étudié le rôle de Gfi1b dans les tumeurs malignes associées aux CSHs. Auparavant, il avait été décrit que l'expression de Gfi1b est augmentée dans les CML et les B-ALL induites par BCR-ABL. De plus, des études provenant de notre laboratoire ont montré que la surexpression de Gfi1b dans un modèle de B-ALL accélère la progression de la maladie et de la morbidité. En contraste, j'ai pu démontrer que la suppression de l'expression de Gfi1b dans un modèle établi de B-ALL entraîne une rémission de la maladie. De plus, l'inhibition pharmacologique de LSD1, un cofacteur de Gfi1b, entraîne la mort des cellules leucémiques in vitro proportionnellement à sa concentration. Ces études suggèrent que Gfi1b joue un rôle fonctionnel central dans les cellules hématopoïétiques normales et malignes.

Innate immunity stands at the front line of host defense and effects protection through constitutive and inducible means. Central to the host response to infection and injury is inflammation, a process initiated by various sensors of danger such as the NOD-like receptors (NLRs), a subfamily of cytosolic Pattern-Recognition Receptors (PRRs). NLRs are activated through oligomerization and assembly of cytosolic signaling platforms, including nodosomes and inflammasomes. While nodosomes activate inflammatory transcriptional pathways, inflammasomes interact with a subfamily of cytosolic enzymes called the inflammatory caspases. This thesis focuses on the functions of the inflammatory caspases within the context of the host response to infection. Expression of caspase-12, a member of the inflammatory caspase family that inhibits inflammasome signaling, is confined to a subset of individuals with African ancestry. This geographic restriction is thought to be related to an increased susceptibility to bacterial infection and sepsis lethality in individuals that express caspase-12. We found that caspase-12 dampened the mucosal immune response to the enteric attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium independently of its effects on the inflammasome. These effects were due to caspase-12 disrupting Nod signalosome assembly and downstream induction of antimicrobial effectors. We also show that High-mobility-group-box 1 (HMGB1), a previously identified mediator of sepsis lethality, is processed and activated by the inflammatory caspase-1. This processing releases two HMGB1 fragments with antagonistic activities that can modulate dendritic cell immunogenicity through the Rage and Tlr4 receptors in response to the tolerogenic signals transmitted by apoptotic cells. In a murine model of sepsis, we show that tolerance to a secondary infection and associated mortality can be regulated by adoptive transfer of dendritic cells treated with the caspase-1 generated HMGB1 fragments. This thesis therefore identifies novel functions of the inflammatory caspases and contributes to our understanding of inflammatory disease. / L'immunité innée se retrouve à la ligne de front des défenses de l'hôte. Ses protections sont conférées par l'entremise de défenses constitutives et inductibles. Centrale à la réponse de l'hôte à l'infection et aux stresses tissulaires est l'inflammation, un processus initié par différents capteurs cellulaires de dangers tels que les NLRs (NOD-like receptors), une sous-famille cytosolique de PRRs (Pattern-recognition receptors). Les NLRs sont activés par oligomerization et l'assemblage de plates-formes de signalisation cytoplasmiques, incluant les nodosomes et inflammasomes. Les nodosomes induisent l'activation de voies de transcription inflammatoires alors que les inflammasomes interagissent avec une sous-famille d'enzymes cytosoliques nommées les caspases inflammatoires. Cette thèse étudie les fonctions des caspases inflammatoires dans le cadre de la réponse de l'hôte à l'infection, l'inflammation et la mort cellulaire. Caspase-12, une caspase inflammatoire qui inhibe l'inflammasome, est exprimée uniquement dans un sous-ensemble de personnes d'ascendance africaine. Cette restriction géographique est crue être reliée à une susceptibilité accrue aux infections bactériennes et la septicémie chez les individus qui expriment cette enzyme. Nous avons constaté que la caspase-12 régule la réponse immunitaire au pathogène entérique Citrobacter rodentium indépendamment de ses effets sur l'inflammasome en diminuant la production de peptides antimicrobiens dans l'intestin. Ces effets sont dus à un assemblage défectueux du nodosome causé par la caspase-12 en aval de l'activation de NF-κB. Nous démontrons également que High-mobility-group-box-1 (HMGB1), un facteur cellulaire contribuant à la mortalité lors de la septicémie, est clivé et activé par la caspase inflammatoire caspase-1. Ce clivage libère deux fragments ayant des activités antagonistes pouvant moduler l'immunogénicité des cellules dendritiques par les récepteurs Rage et Tlr4 en réponse aux signaux tolérogènes transmis par les cellules apoptotiques. Dans un modèle murin de septicémie, nous démontrons que la tolérance à une infection secondaire ainsi que son taux de mortalité peuvent être réglementés par transfert adoptif de cellules dendritiques traitées avec les fragments HMGB1 produits par la caspase-1. Cette thèse contribue donc au savoir scientifique en identifiant des fonctions préalablement inconnues des caspases inflammatoires.

Antibodies are crucial components of the adaptive immune arsenal against invading pathogens. Production of high-affinity class-switched antibodies relies on follicular helper T (Tfh) cells, a distinct subset of CD4 helper T cells that migrate into B cell follicles and promote B cell differentiation into plasma cells during germinal center (GC) reactions. The CD28-like costimulatory receptor Inducible Costimulator (ICOS) is expressed on the surface of activated T cells and is crucial for the generation of Tfh cells in mice and humans, but the molecular mechanisms remained unknown. ICOS had been known as a potent activator of phosphoinositide 3-kinase (PI3K), but the role of ICOS-mediated PI3K activation in T cells has been poorly understood. The work presented here is a compilation of two studies that highlight the unique role of PI3K in ICOS-mediated Tfh cell differentiation and function. In the first study, presented in Chapter II, I analyzed a knock-in strain of mice possessing a point mutation in the cytoplasmic tail of ICOS that prevents binding of PI3K (ICOS-YF). I show that ICOS-mediated PI3K activation is crucial for the generation of Tfh cells, and in turn, GC formation, antibody class-switch, and affinity maturation. The ICOS-PI3K axis was crucial for the potentiation of T cell receptor (TCR)-mediated expression of IL-21 and IL-4, key cytokines involved in T cell-mediated B cell help. I also show data that strongly suggests that ICOS and CD28 have differential roles in the multistep process of Tfh cell differentiation, where CD28 is mainly involved in the early expansion of CD4 T cells through non-PI3K signaling mechanisms, while ICOS is involved in the later stages of Tfh cell differentiation in a PI3K-dependent manner. In the study presented in Chapter III, I show that ICOS costimulation enhances TCR-mediated activation of the key translation mediators 4E-BP1 and S6K, in a manner dependent on PI3K. Consistently, I show that the ICOS-PI3K axis enhances the formation of polysomes on IL-4 mRNA. Using an in vitro T-B cell co-culture system, I provide evidence that ICOS mutant CD4 T cells have impaired ability to induce B cell differentiation due to a limited production of IL-4. These findings suggest that ICOS-PI3K signaling facilitates targeted delivery of IL-4 from helper T cells to cognate B cells during T cell-B cell interactions in the GC. Thus, I demonstrate that PI3K is a key downstream signaling component in ICOS signaling during Tfh cell generation. I also show that ICOS-PI3K signaling can alter translational efficiency of pre-existing mRNAs suggesting ICOS' potential role in regulating the function of Tfh cells. / Les anticorps sont des composantes cruciales de l'arsenal que le système immunitaire adaptatif utilise contre les pathogènes invasifs. La production d'anticorps de haute-affinité réarrangés par commutation isotypique nécessite l'apport des lymphocytes T auxiliaires folliculaires (Tfh), un sous-type de lymphocytes T auxiliaires CD4+ qui migrent dans les follicules nodules lymphatiques et y promeuvent la différentiation des cellules B en cellules plasmatiques, le tout durant les réactions du centre germinatif (GC). Le récepteur de costimulation de type CD28 Costimulateur Inductible (ICOS) est exprimé sur la surface des cellules T activées et joue un rôle critique dans la génération de cellules Tfh autant chez la souris que l'humain, cependant les mécanismes moléculaires demeurent inconnus. Jusqu'à présent, ICOS était reconnu comme un puissant activateur de la phosphatidyl inositol-3 kinase (PI3K), mais le rôle de l'activation de PI3K médiée par ICOS dans les cellules T demeure mal compris. Le travail présenté dans cette thèse retrace deux études qui décrivent le rôle unique de PI3K dans la fonction et la différentiation des cellules Tfh médiées par ICOS. Dans la première étude, présenté dans le Chapitre II, j'ai analysé une ligné de souris 'knock-in' possédant une mutation ponctuelle dans la région cytoplasmique de ICOS empêchant ainsi la liaison de PI3K (ICOS-YF). Je démontre que l'activation de PI3K médiée par ICOS demeure cruciale pour la génération de cellules Tfh, ainsi qu'en conséquence la formation des GC, la commutation isotypique d'anticorps et la maturation d'affinité. L'axe ICOS-PI3K s'avère critique pour la potentialisation de l'expression médiée par le récepteur de cellules T (TCR) de IL-21 et IL-4, des cytokines clés impliquées dans l'aide aux cellules B médiée par les cellules T. J'illustre également des résultats qui prouvent que ICOS et CD28 exercent des rôles distinct dans le processus complexe de la différentiation des cellules Tfh, où CD28 est principalement impliqué dans l'expansion précoce des cellules T CD4+ par l'entremise de mécanismes de signalisation indépendants de PI3K, tandis que ICOS s'engage plutôt de façon PI3K-dépendante dans les étapes tardives de la différentiation des cellules Tfh. Dans la seconde étude au Chapitre III, je révèle que la costimulation par ICOS augmente l'activation médiée par le TCR de médiateurs clés de la traduction de 4E-BP1 ainsi que S6K de façon dépendante à PI3K. De façon cohérente, je démontre que l'axe ICOS-PI3K augmente la formation de polysomes sur l'ARN messager d'IL-4. En utilisant un système in-vitro de co-culture de cellules T et B, je fourni des preuves que les cellules T CD4+ mutantes pour ICOS ont une capacité détérioré d'induire la différentiation de cellules B due à une production limitée d'IL-4. Ces découvertes suggèrent que la signalisation par ICOS-PI3K facilite l'acheminement dirigé d'IL-4 d'une cellule T auxiliaire à une cellule B apparentée durant une interaction entre les deux types cellulaires dans le GC. En conclusion, je démontre que PI3K est une composante de signalisation clé en aval de la signalisation par ICOS durant la génération de Tfh. De plus, je prouve que la voix ICOS-PI3K peut modifier l'efficacité de traduction d'ARN messager préexistant suggérant un rôle potentiel d'ICOS dans la régulation de la fonction des cellules Tfh.

We have investigated the effects of graft-versus-host disease on T cell differentiation in the murine thymus. Flow cytometry analysis of L3T4 and Lyt-2 antigen expression on thymocytes along with immunofluorescence microscopy were employed to assess T cell phenotypes in thymuses of GVH mice. GVH reactions were induced by injecting 40 $ times$ 10$ sp6$ C57BL/6 (B6) or A strain lymphoid cells into C57BL/6 $ times$ A F$ sb1$, (B6AF$ sb1$) mice. Thymocyte populations were quantitated on different days after GVH induction. Our results demonstrate that single positive L3T4 cells are present in the murine GVH thymus, yet they have not acquired cortisone resistance, a trait normally attributed to this mature thymic subset. It appears that the GVH dysplastic thymus can support the differentiation of L3T4$ sp{+}$Lyt-2$ sp{-}$ cells however, such a thymus is unable to confer cortisone resistance upon this population.