Introdução: A CALPAIN5faz parte da família das cisteínas proteases e está relacionada com a regulação de inúmeras funções celulares, entre elas a diferenciação e a apoptose. Estudos com microarrays identificaram a CALPAIN5como um alvo da açãotranscripcional do HOXA10em úteros de camundongos. Objetivos: No presente estudo avaliou-se a regulação da CALPAIN5pelo HOXA10 em células endometriais, a expressão da CALPAIN5no endométrio durante todo o ciclo menstrual, e na decídua do primeiro e terceiro trimestres de gestações normais, e o padrão de expressão anormal desse gene na pré-eclampsia e endometriose. Material e Métodos: Foram obtidas dez biópsias endometriais (cinco na fase proliferativa e cinco na fase secretora) depacientes férteis. Biópsias de lesões de endometriose, confirmadas por histopatologia,foram retiradas de dez mulheres durante procedimento vídeo-laparoscópico. Amostras de decídua foram coletadas em três diferentes ocasiões: três amostras do primeiro trimestre,cinco amostras no terceiro trimestre e cinco amostras de pacientes com pré-clâmpsia no terceiro trimestre. Identificou-se a proteína da CALPAIN5utilizando imunohistoquimica (IHC) no endométrio eutópico, ectópico e na decídua. Os resultados da IHC foram quantificados, a partir dedois diferentes observadores, utilizando-se Hscorepara células estromais, epiteliais e deciduais. Transfeccionou-se 4,0µg de pcDNA/HOXA10e 20µM siRNA/HOXA10em cultura de células estromais endometriais humanas (HESC) e células epiteliais endometriais humanas (Ishikawa), assim como os seus respectivos controles. A transfecção foi realizada em quadruplicata quando a cultura de células apresentava confluência de 60-70%. Após 48 horas do procedimento o RNA foi extraído, que deu origem a DNA complementar e após uma reação de cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) foi realizada, em triplicata, para determinar o padrão de expressão do HOXA10e CALPAIN5. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes ANOVA com test pos-hocpara o Hscoree teste tpara os resultados da PCR em tempo real. Resultados: CALPAIN5 é expressadurante todo o ciclo menstrual tanto nas células estromais como epiteliais glandulares, e está mais expressa na decídua do primeiro trimestre. Na endometriose CALPAIN5 se mostrou pouco evidente em ambas as células endometriais (estromais e glandulares), quando comparadas de forma geral com as células endometriais eutópicas das pacientes controles, sendo que sua expressão reduziu em 50% (p<0,05). Nas decíduas de pacientes com pré-eclampsia CALPAIN5 apresentou-se mais expressa que no grupo controle (p<0,05). Nas célulasestromais endometriais o pcDNA/HOXA10aumentou a expressão da CALPAIN5em 11 vezes (p<0,05) e a transfecção com siRNA/HOXA10reduziu a expressão da CALPAIN5em 23 vezes (p<0,05). Conclusão: O HOXA10regula a expressão genética da CALPAIN5nas células endometriais. CALPAIN5 é expressa no endométrio normal e tem sua expressão aumentada nas células deciduais do primeiro trimestre em relação àsfases do ciclo menstrual. CALPAIN5 está pouco expressa no endométrio ectópico na endometriose e mais expressa nas células deciduais na pré-eclampsia grave quando comparados com seus respectivos controles. / BACKGROUND: CALPAIN5is member of the calpain-like cystein protease family and has been implicated in the regulation of a variety of cellular functions, including differentiation and apoptosis. Research with microarray screen identified CALPAIN5as target of HOXA10 transcriptional control in murine endometrium. OBJECTIVES: We propose in this study to demonstrate regulated CALPAIN5expression in endometrium, and 3rd trimester deciduas and an abnormal expression pattern of this gene in pre eclampsia and endometriosis . MATERIALS & METHODS: Ten endometrial biopsies (5 proliferative phase and 5 secretory phase) were obtained from fertile controls. Histologically confirmed biopsies of endometriosis were obtained from 10 women atthe time of laparoscopy. Five third trimester decidual samples and 3 first trimester deciduas samples from controls, and five 3rd trimester decidual samples from women with pre-eclampsia were obtained at the time of labor. Immunohistochemistry (IHC) was used to identify CALPAIN5protein in eutopic and ectopic endometrium as well as in decidua. IHC was performed with CALPAIN5polyclonal antibody. IHC results were assessed by 2 evaluators blinded to the study groups, and H-SCORES were determined for the stroma, glands and decidua. The human endometrial stromal cell line, HESC, the human endometrial epithelial cell line, Ishikawa were transfected with either 4.0µg pcDNA/HOXA10or 20µM HOXA10siRNA; transfection with empty pcDNA vector or nonspecific siRNA served as respective controls. Cells were transfected in quadruplicate at 60-70% confluence. Forty eight hours after the transfection total RNA was isolated. qRT-PCR was performed in duplicated to determine expression levels of HOXA10and CALPAIN5in each group. Statistical analysis was performed with ANOVA test pos-hocto Hscoreand ttest for real time PCRRESULTS: CALPAIN5was expressed in endometrial stromal and glandular cells throughout the menstrual cycle, and increased expression was noted in the first trimester decidua phase. There was a decrease in CALPAIN5expression in both stromal and glandular cells in endometriosis to 50% ofthat seen in fertile controls (p<0.05). CALPAIN 5 was also expressed in 3rd trimester decidua obtained from pre-eclamptics at higher levels than 3rd trimester control decidua (p<0.05). The regulatory relationship between HOXA10 and CALPAIN5was established by transient transfection analysis. CALPAIN5 gene expression increased 11-fold (p<0.05) after pcDNA/HOXA10transfection of the HESC, and decreased 23-fold (p<0.05) after HOXA10siRNA treatment. CONCLUSIONS: CALPAIN5 expression is regulated by HOXA10. CALPAIN5is expressed in normal endometrium and at upregulated in the decidua ofwomen with pre-eclampsia. CALPAIN5 expression is decreased in endometriosis compared to eutopic endometrium.

Introdução: A CALPAIN5faz parte da família das cisteínas proteases e está relacionada com a regulação de inúmeras funções celulares, entre elas a diferenciação e a apoptose. Estudos com microarrays identificaram a CALPAIN5como um alvo da açãotranscripcional do HOXA10em úteros de camundongos. Objetivos: No presente estudo avaliou-se a regulação da CALPAIN5pelo HOXA10 em células endometriais, a expressão da CALPAIN5no endométrio durante todo o ciclo menstrual, e na decídua do primeiro e terceiro trimestres de gestações normais, e o padrão de expressão anormal desse gene na pré-eclampsia e endometriose. Material e Métodos: Foram obtidas dez biópsias endometriais (cinco na fase proliferativa e cinco na fase secretora) depacientes férteis. Biópsias de lesões de endometriose, confirmadas por histopatologia,foram retiradas de dez mulheres durante procedimento vídeo-laparoscópico. Amostras de decídua foram coletadas em três diferentes ocasiões: três amostras do primeiro trimestre,cinco amostras no terceiro trimestre e cinco amostras de pacientes com pré-clâmpsia no terceiro trimestre. Identificou-se a proteína da CALPAIN5utilizando imunohistoquimica (IHC) no endométrio eutópico, ectópico e na decídua. Os resultados da IHC foram quantificados, a partir dedois diferentes observadores, utilizando-se Hscorepara células estromais, epiteliais e deciduais. Transfeccionou-se 4,0µg de pcDNA/HOXA10e 20µM siRNA/HOXA10em cultura de células estromais endometriais humanas (HESC) e células epiteliais endometriais humanas (Ishikawa), assim como os seus respectivos controles. A transfecção foi realizada em quadruplicata quando a cultura de células apresentava confluência de 60-70%. Após 48 horas do procedimento o RNA foi extraído, que deu origem a DNA complementar e após uma reação de cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) foi realizada, em triplicata, para determinar o padrão de expressão do HOXA10e CALPAIN5. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes ANOVA com test pos-hocpara o Hscoree teste tpara os resultados da PCR em tempo real. Resultados: CALPAIN5 é expressadurante todo o ciclo menstrual tanto nas células estromais como epiteliais glandulares, e está mais expressa na decídua do primeiro trimestre. Na endometriose CALPAIN5 se mostrou pouco evidente em ambas as células endometriais (estromais e glandulares), quando comparadas de forma geral com as células endometriais eutópicas das pacientes controles, sendo que sua expressão reduziu em 50% (p<0,05). Nas decíduas de pacientes com pré-eclampsia CALPAIN5 apresentou-se mais expressa que no grupo controle (p<0,05). Nas célulasestromais endometriais o pcDNA/HOXA10aumentou a expressão da CALPAIN5em 11 vezes (p<0,05) e a transfecção com siRNA/HOXA10reduziu a expressão da CALPAIN5em 23 vezes (p<0,05). Conclusão: O HOXA10regula a expressão genética da CALPAIN5nas células endometriais. CALPAIN5 é expressa no endométrio normal e tem sua expressão aumentada nas células deciduais do primeiro trimestre em relação àsfases do ciclo menstrual. CALPAIN5 está pouco expressa no endométrio ectópico na endometriose e mais expressa nas células deciduais na pré-eclampsia grave quando comparados com seus respectivos controles. / BACKGROUND: CALPAIN5is member of the calpain-like cystein protease family and has been implicated in the regulation of a variety of cellular functions, including differentiation and apoptosis. Research with microarray screen identified CALPAIN5as target of HOXA10 transcriptional control in murine endometrium. OBJECTIVES: We propose in this study to demonstrate regulated CALPAIN5expression in endometrium, and 3rd trimester deciduas and an abnormal expression pattern of this gene in pre eclampsia and endometriosis . MATERIALS & METHODS: Ten endometrial biopsies (5 proliferative phase and 5 secretory phase) were obtained from fertile controls. Histologically confirmed biopsies of endometriosis were obtained from 10 women atthe time of laparoscopy. Five third trimester decidual samples and 3 first trimester deciduas samples from controls, and five 3rd trimester decidual samples from women with pre-eclampsia were obtained at the time of labor. Immunohistochemistry (IHC) was used to identify CALPAIN5protein in eutopic and ectopic endometrium as well as in decidua. IHC was performed with CALPAIN5polyclonal antibody. IHC results were assessed by 2 evaluators blinded to the study groups, and H-SCORES were determined for the stroma, glands and decidua. The human endometrial stromal cell line, HESC, the human endometrial epithelial cell line, Ishikawa were transfected with either 4.0µg pcDNA/HOXA10or 20µM HOXA10siRNA; transfection with empty pcDNA vector or nonspecific siRNA served as respective controls. Cells were transfected in quadruplicate at 60-70% confluence. Forty eight hours after the transfection total RNA was isolated. qRT-PCR was performed in duplicated to determine expression levels of HOXA10and CALPAIN5in each group. Statistical analysis was performed with ANOVA test pos-hocto Hscoreand ttest for real time PCRRESULTS: CALPAIN5was expressed in endometrial stromal and glandular cells throughout the menstrual cycle, and increased expression was noted in the first trimester decidua phase. There was a decrease in CALPAIN5expression in both stromal and glandular cells in endometriosis to 50% ofthat seen in fertile controls (p<0.05). CALPAIN 5 was also expressed in 3rd trimester decidua obtained from pre-eclamptics at higher levels than 3rd trimester control decidua (p<0.05). The regulatory relationship between HOXA10 and CALPAIN5was established by transient transfection analysis. CALPAIN5 gene expression increased 11-fold (p<0.05) after pcDNA/HOXA10transfection of the HESC, and decreased 23-fold (p<0.05) after HOXA10siRNA treatment. CONCLUSIONS: CALPAIN5 expression is regulated by HOXA10. CALPAIN5is expressed in normal endometrium and at upregulated in the decidua ofwomen with pre-eclampsia. CALPAIN5 expression is decreased in endometriosis compared to eutopic endometrium.

INTRODUÇÃO: Apesar de a endometriose profunda (EPF) ser a forma da doença de maior repercussão clínica, os estudos sobre a doença costumam ser baseados em lesões de endometriose ovariana (EOV) e peritoneal (EPT). A patogênese da EPF ainda é objeto de amplo debate, pois há poucos estudos feitos exclusivamente com lesões de EPF. O fator de transcrição codificado pelo gene homeobox A10 (HOXA10) regula a conferência de identidade tecidual de útero ao ducto paramesonéfrico indiferenciado durante o período embrionário. O gene mantém um padrão de expressão temporal e espacial bem definido e, durante a fase adulta, continua expresso no miométrio e endométrio. Sugere-se que HOXA10 esteja implicado na patogênese da endometriose, pois é expresso em EOV, EPT, endometriose pulmonar e endometriose retovaginal, um tipo de EPF. Possivelmente, o gene HOXA10 seja necessário para conferir identidade de endometriose a um tecido indiferenciado. O estradiol e a progesterona ativam a transcrição do gene HOXA10 e regulam diretamente sua ação. Esses hormônios estão envolvidos na patogênese da EPF, e suas atividades podem ser inferidas pelo estudo da expressão tecidual de seus receptores. A endometriose de reto-sigmoide (ERS) é um modelo representativo para o estudo da EPF. Neste estudo, avaliamos a expressão proteica do fator de transcrição HOXA10, das isoformas ? (ER-alfa) e beta (ER-beta) dos receptores de estrogênio, e do receptor de progesterona AB (PR-AB) e sua isoforma B (PR-B) na lesão (LES) e no tecido muscular liso perilesional (TMLP) de ERS de pacientes inférteis, durante as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. MÉTODOS: amostras de LES e TMLP de ERS de 18 pacientes (9 operadas em cada fase do ciclo menstrual) foram agrupadas em blocos de microarranjos de tecidos (tissue microarray). As amostras foram coradas com anticorpos específicos para análise imunoistoquímica de cada uma das proteínas. Foram então avaliadas por microscopia ótica (MO) e pela análise das imagens digitalizadas das lâminas com por um software específico, a análise morfométrica (AM). RESULTADOS: HOXA10 foi expresso no estroma de LES de ERS durante a fase secretora, de acordo com a MO. ER-alfa e ER-betaforam expressos em glândulas e estroma de LES e TMLP de ERS durante ambas as fases do ciclo, de acordo com a MO e a AM. PR-AB e PR-B foram expressos em glândulas e estroma de LES de ERS durante ambas as fases do ciclo, de acordo com a MO. PR-B foi mais expresso durante a fase secretora, independentemente do local de expressão, segundo a AM. A expressão de HOXA10 correlacionou-se diretamente com PR-AB e PR-B na ERS, segundo a AM. Não houve correlação entre ER-alfa e ER-beta com HOXA10, PR-AB ou PR-B em nenhuma fase do ciclo ou local de expressão de ERS. CONCLUSÕES: HOXA10 é expresso em ERS, um local fora do seu eixo espacial de expressão. A presença de HOXA10 pode ser necessária para conferir a identidade \"de novo\" na EPF, incluindo ERS. A progesterona pode ativar o gene HOXA10 e regular esta ação, possivelmente mediada por PR-B. O estradiol exerce sua ação mitógena na ERS através ER-alfa e ER-beta / INTRODUCTION: Although deep endometriosis (DE) is the major clinical form of endometriosis, studies regarding the disease are typically based on ovarian (OE) and peritoneal (PE) lesions. DE pathogenesis is still a matter of great discussion because there are few studies exclusively involving DE lesions. The transcription factor encoded by the homeobox gene A10 (HOXA10) regulates the identity imparted to the undifferentiated paramesonephric duct during embryogenesis. The gene is expressed in the myometrium and endometrium during adult life in a well-defined spatial and temporal mode. It has been suggested that HOXA10 plays a role in endometriosis pathogenesis because it is expressed in OE, PE, pulmonary endometriosis, and rectovaginal endometriosis, which is a clinical form of DE. Thus, HOXA10 may be necessary for \"de novo\" endometrial development from undifferentiated tissues. Both estradiol and progesterone activate HOXA10 transcription and directly regulate its action. These hormones are involved in DE pathogenesis, and therefore their activities could be assessed by studying the tissue expression of their receptors. Rectosigmoid endometriosis (RE) is a representative model for studying DE. In this study, we evaluated the protein expression of HOXA10, the estrogen receptor (ER) isoforms alfa (ER-alfa) and beta (ER-beta), the progesterone receptor AB (PR), and the PR isoform B (PR-B) in lesions (LES) and adjacent smooth muscle (SM) of RE from infertile patients during the proliferative and secretory phases of the menstrual cycle. METHODS: LES and SM samples from RE patients were grouped in tissue microarray blocks. Each of the proteins was analyzed by immunohistochemistry using regular optical microscopy (OM) and a software-assisted analysis of digitalized images as well as morphometric analysis (MA). RESULTS: HOXA10 was expressed in the stroma of the LES during the secretory phase based on OM. ER-alfa and ER-beta were expressed in the glands and stroma of LES and SM during both phases based on OM and MA. PR and PR-B were expressed in the glands and stroma of LES during both phases; however, PR-B had higher expression during the secretory phase, independent of its expression in the LES or SM. HOXA10 expression was directly correlated with PR and PR-B expression in RE. In addition, there was no correlation between the expression of ER-alfa and ER-beta with HOXA10, PR, or PR-B during any phase of the menstrual cycle or site of expression. CONCLUSIONS: HOXA10 is expressed in RE outside of its spatial domain of expression, and may be necessary for \"de novo\" development of DE, including RE. Progesterone might stimulate HOXA10 expression and regulate this action, which is most likely mediated by PR-B. Moreover, estradiol exerts its mitogenic effect in RE though ER-alfa and ER-beta

INTRODUÇÃO: Apesar de a endometriose profunda (EPF) ser a forma da doença de maior repercussão clínica, os estudos sobre a doença costumam ser baseados em lesões de endometriose ovariana (EOV) e peritoneal (EPT). A patogênese da EPF ainda é objeto de amplo debate, pois há poucos estudos feitos exclusivamente com lesões de EPF. O fator de transcrição codificado pelo gene homeobox A10 (HOXA10) regula a conferência de identidade tecidual de útero ao ducto paramesonéfrico indiferenciado durante o período embrionário. O gene mantém um padrão de expressão temporal e espacial bem definido e, durante a fase adulta, continua expresso no miométrio e endométrio. Sugere-se que HOXA10 esteja implicado na patogênese da endometriose, pois é expresso em EOV, EPT, endometriose pulmonar e endometriose retovaginal, um tipo de EPF. Possivelmente, o gene HOXA10 seja necessário para conferir identidade de endometriose a um tecido indiferenciado. O estradiol e a progesterona ativam a transcrição do gene HOXA10 e regulam diretamente sua ação. Esses hormônios estão envolvidos na patogênese da EPF, e suas atividades podem ser inferidas pelo estudo da expressão tecidual de seus receptores. A endometriose de reto-sigmoide (ERS) é um modelo representativo para o estudo da EPF. Neste estudo, avaliamos a expressão proteica do fator de transcrição HOXA10, das isoformas ? (ER-alfa) e beta (ER-beta) dos receptores de estrogênio, e do receptor de progesterona AB (PR-AB) e sua isoforma B (PR-B) na lesão (LES) e no tecido muscular liso perilesional (TMLP) de ERS de pacientes inférteis, durante as fases proliferativa e secretora do ciclo menstrual. MÉTODOS: amostras de LES e TMLP de ERS de 18 pacientes (9 operadas em cada fase do ciclo menstrual) foram agrupadas em blocos de microarranjos de tecidos (tissue microarray). As amostras foram coradas com anticorpos específicos para análise imunoistoquímica de cada uma das proteínas. Foram então avaliadas por microscopia ótica (MO) e pela análise das imagens digitalizadas das lâminas com por um software específico, a análise morfométrica (AM). RESULTADOS: HOXA10 foi expresso no estroma de LES de ERS durante a fase secretora, de acordo com a MO. ER-alfa e ER-betaforam expressos em glândulas e estroma de LES e TMLP de ERS durante ambas as fases do ciclo, de acordo com a MO e a AM. PR-AB e PR-B foram expressos em glândulas e estroma de LES de ERS durante ambas as fases do ciclo, de acordo com a MO. PR-B foi mais expresso durante a fase secretora, independentemente do local de expressão, segundo a AM. A expressão de HOXA10 correlacionou-se diretamente com PR-AB e PR-B na ERS, segundo a AM. Não houve correlação entre ER-alfa e ER-beta com HOXA10, PR-AB ou PR-B em nenhuma fase do ciclo ou local de expressão de ERS. CONCLUSÕES: HOXA10 é expresso em ERS, um local fora do seu eixo espacial de expressão. A presença de HOXA10 pode ser necessária para conferir a identidade \"de novo\" na EPF, incluindo ERS. A progesterona pode ativar o gene HOXA10 e regular esta ação, possivelmente mediada por PR-B. O estradiol exerce sua ação mitógena na ERS através ER-alfa e ER-beta / INTRODUCTION: Although deep endometriosis (DE) is the major clinical form of endometriosis, studies regarding the disease are typically based on ovarian (OE) and peritoneal (PE) lesions. DE pathogenesis is still a matter of great discussion because there are few studies exclusively involving DE lesions. The transcription factor encoded by the homeobox gene A10 (HOXA10) regulates the identity imparted to the undifferentiated paramesonephric duct during embryogenesis. The gene is expressed in the myometrium and endometrium during adult life in a well-defined spatial and temporal mode. It has been suggested that HOXA10 plays a role in endometriosis pathogenesis because it is expressed in OE, PE, pulmonary endometriosis, and rectovaginal endometriosis, which is a clinical form of DE. Thus, HOXA10 may be necessary for \"de novo\" endometrial development from undifferentiated tissues. Both estradiol and progesterone activate HOXA10 transcription and directly regulate its action. These hormones are involved in DE pathogenesis, and therefore their activities could be assessed by studying the tissue expression of their receptors. Rectosigmoid endometriosis (RE) is a representative model for studying DE. In this study, we evaluated the protein expression of HOXA10, the estrogen receptor (ER) isoforms alfa (ER-alfa) and beta (ER-beta), the progesterone receptor AB (PR), and the PR isoform B (PR-B) in lesions (LES) and adjacent smooth muscle (SM) of RE from infertile patients during the proliferative and secretory phases of the menstrual cycle. METHODS: LES and SM samples from RE patients were grouped in tissue microarray blocks. Each of the proteins was analyzed by immunohistochemistry using regular optical microscopy (OM) and a software-assisted analysis of digitalized images as well as morphometric analysis (MA). RESULTS: HOXA10 was expressed in the stroma of the LES during the secretory phase based on OM. ER-alfa and ER-beta were expressed in the glands and stroma of LES and SM during both phases based on OM and MA. PR and PR-B were expressed in the glands and stroma of LES during both phases; however, PR-B had higher expression during the secretory phase, independent of its expression in the LES or SM. HOXA10 expression was directly correlated with PR and PR-B expression in RE. In addition, there was no correlation between the expression of ER-alfa and ER-beta with HOXA10, PR, or PR-B during any phase of the menstrual cycle or site of expression. CONCLUSIONS: HOXA10 is expressed in RE outside of its spatial domain of expression, and may be necessary for \"de novo\" development of DE, including RE. Progesterone might stimulate HOXA10 expression and regulate this action, which is most likely mediated by PR-B. Moreover, estradiol exerts its mitogenic effect in RE though ER-alfa and ER-beta