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A via RAS/RAF/MEK/ERK é frequentemente hiperativada em diversos tumores. Em leucemias sua ativação pode ocorrer, dentre outros mecanismos, a partir de mutações pontuais nos genes da família RAS, que são relevantes nas leucemias linfóide e mielóide agudas (LLA e LMA), ou a partir da atividade da tirosina-quinase BCR-ABL, que é responsável por promover a tumorigênese na leucemia mielóide crônica (LMC) e em alguns casos de LLA. A hiperativação dessa via estimula a proliferação celular e, consequentemente, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que é um dos principais mecanismos envolvidos com a indução de senescência celular em tumores. Assim sendo, as células tumorais que apresentam o gene RAS mutado são criticamente dependentes de mecanismos de feedback para regular a ativação da via. Jang et al. demonstraram que a ubiquitina-ligase HUWE1 atua em um mecanismo de feedback negativo que controla a ativação de ERK1/2 e apesar de amplamente estudada no contexto da tumorigênese, a atuação dessa molécula em eventos relacionados à leucemogênese ainda não foi descrita. No presente estudo, linhagens celulares leucêmicas e células tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas (HSPCs) com mutação KRASG12V foram transduzidas com partículas lentivirais miR-E para o silenciamento gênico de HUWE1. Ensaios de proliferação celular, apoptose, análise do ciclo celular, produção de ROS e análise da expressão gênica e proteica foram realizados nas linhagens celulares; análise do crescimento cumulativo, área de formação de cobblestones, capacidade clonogênica e análise do perfil de diferenciação celular foram realizados nas HSPCs. Nas linhagens celulares observouse que o silenciamento de HUWE1 reduziu a capacidade proliferativa das linhagens Nalm-6, K562 e THP-1, porém não causou nenhum prejuízo à capacidade proliferativa da linhagem HL-60. Além disso, causou a redução da produção de ROS (p<0,05), associada à redução das taxas de apoptose (p<0,01), principalmente na linhagem K562, na qual também promoveu a ativação de ERK1/2 . Em HSPCs, observou-se a redução da capacidade proliferativa das culturas que expressavam o oncogene KRASG12V associado ao silenciamento de HUWE1. Nas mesmas condições foi observada uma drástica redução na capacidade clonogênica das HSPCs (p<0,001), em especial as do tipo BFU-E. O silenciamento de HUWE1 também alterou o perfil de diferenciação celular para a linhagem monocítica. Os resultados sugerem que HUWE1 pode participar do processo de leucemogênese e diferenciação de HSPCs humanas participando na modulação da via RAS/RAF/MEK/ERK. / The RAS/RAF/MEK/ERK pathway is frequently hyperactivated in several tumors. In leukemia, this activation can arise, among other mechanisms, from point mutations in the RAS genes, which are important in acute lymphoid leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML), or from chromosomal translocations such as the BCR-ABL gene, which is a driver mutation in chronic myeloid leukemia (CML) and some cases of ALL. The hyperactivation of this pathway stimulates cell proliferation and, consequently, the production of reactive oxygen species (ROS), which is one of the main mechanisms involved with induction of cellular senescence in tumors. Thus, tumor cells that harbor the mutated RAS gene are critically dependent on feedback mechanisms to regulate pathway activation. Jang et al. demonstrated that the ubiquitinligase HUWE1 acts on a negative feedback mechanism that controls the activation of ERK1/2. Although widely studied in the context of tumorigenesis, the role of this molecule in events related to leukemogenesis has not yet been described. In this study, leukemia cell lines and human hematopoietic stem and progenitors cells (HSPCs) with KRASG12V mutation were transduced with miR-E lentiviral particles for HUWE1 knockdown. Cell proliferation, apoptosis, cell cycle analysis, ROS production and analysis of gene and protein expression were performed in cell lines; cumulative growth analysis, cobblestones area formations, clonogenic capacity and differentiation profile analysis were performed in HSPCs. In cell lines, it was observed that HUWE1 knockdown reduced the proliferative capacity of Nalm-6, K562 and THP-1, but not of HL-60. Besides that, it caused a reduction in ROS production (p<0,05), associated with reduction of apoptosis rates (p<0,01), especially in K562 in which it also promoted activation of ERK1/2. In HSPCs, a reduction of the proliferative capacity was observed in cultures expressing KRASG12V in combination with HUWE1 knockdown. In the same conditions, a drastic reduction of clonogenic capacity (p<0,001), especially of BFU-E colonies, was observed. HUWE1 knockdown also changed differentiation profile to the monocytic lineage. Results suggest that HUWE1 might play a role in leukemogenesis process and differentiation of human HSPCs, acting in the modulation of RAS/RAF/MEK/ERK.

A via RAS/RAF/MEK/ERK é frequentemente hiperativada em diversos tumores. Em leucemias sua ativação pode ocorrer, dentre outros mecanismos, a partir de mutações pontuais nos genes da família RAS, que são relevantes nas leucemias linfóide e mielóide agudas (LLA e LMA), ou a partir da atividade da tirosina-quinase BCR-ABL, que é responsável por promover a tumorigênese na leucemia mielóide crônica (LMC) e em alguns casos de LLA. A hiperativação dessa via estimula a proliferação celular e, consequentemente, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que é um dos principais mecanismos envolvidos com a indução de senescência celular em tumores. Assim sendo, as células tumorais que apresentam o gene RAS mutado são criticamente dependentes de mecanismos de feedback para regular a ativação da via. Jang et al. demonstraram que a ubiquitina-ligase HUWE1 atua em um mecanismo de feedback negativo que controla a ativação de ERK1/2 e apesar de amplamente estudada no contexto da tumorigênese, a atuação dessa molécula em eventos relacionados à leucemogênese ainda não foi descrita. No presente estudo, linhagens celulares leucêmicas e células tronco e progenitoras hematopoiéticas humanas (HSPCs) com mutação KRASG12V foram transduzidas com partículas lentivirais miR-E para o silenciamento gênico de HUWE1. Ensaios de proliferação celular, apoptose, análise do ciclo celular, produção de ROS e análise da expressão gênica e proteica foram realizados nas linhagens celulares; análise do crescimento cumulativo, área de formação de cobblestones, capacidade clonogênica e análise do perfil de diferenciação celular foram realizados nas HSPCs. Nas linhagens celulares observouse que o silenciamento de HUWE1 reduziu a capacidade proliferativa das linhagens Nalm-6, K562 e THP-1, porém não causou nenhum prejuízo à capacidade proliferativa da linhagem HL-60. Além disso, causou a redução da produção de ROS (p<0,05), associada à redução das taxas de apoptose (p<0,01), principalmente na linhagem K562, na qual também promoveu a ativação de ERK1/2 . Em HSPCs, observou-se a redução da capacidade proliferativa das culturas que expressavam o oncogene KRASG12V associado ao silenciamento de HUWE1. Nas mesmas condições foi observada uma drástica redução na capacidade clonogênica das HSPCs (p<0,001), em especial as do tipo BFU-E. O silenciamento de HUWE1 também alterou o perfil de diferenciação celular para a linhagem monocítica. Os resultados sugerem que HUWE1 pode participar do processo de leucemogênese e diferenciação de HSPCs humanas participando na modulação da via RAS/RAF/MEK/ERK. / The RAS/RAF/MEK/ERK pathway is frequently hyperactivated in several tumors. In leukemia, this activation can arise, among other mechanisms, from point mutations in the RAS genes, which are important in acute lymphoid leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML), or from chromosomal translocations such as the BCR-ABL gene, which is a driver mutation in chronic myeloid leukemia (CML) and some cases of ALL. The hyperactivation of this pathway stimulates cell proliferation and, consequently, the production of reactive oxygen species (ROS), which is one of the main mechanisms involved with induction of cellular senescence in tumors. Thus, tumor cells that harbor the mutated RAS gene are critically dependent on feedback mechanisms to regulate pathway activation. Jang et al. demonstrated that the ubiquitinligase HUWE1 acts on a negative feedback mechanism that controls the activation of ERK1/2. Although widely studied in the context of tumorigenesis, the role of this molecule in events related to leukemogenesis has not yet been described. In this study, leukemia cell lines and human hematopoietic stem and progenitors cells (HSPCs) with KRASG12V mutation were transduced with miR-E lentiviral particles for HUWE1 knockdown. Cell proliferation, apoptosis, cell cycle analysis, ROS production and analysis of gene and protein expression were performed in cell lines; cumulative growth analysis, cobblestones area formations, clonogenic capacity and differentiation profile analysis were performed in HSPCs. In cell lines, it was observed that HUWE1 knockdown reduced the proliferative capacity of Nalm-6, K562 and THP-1, but not of HL-60. Besides that, it caused a reduction in ROS production (p<0,05), associated with reduction of apoptosis rates (p<0,01), especially in K562 in which it also promoted activation of ERK1/2. In HSPCs, a reduction of the proliferative capacity was observed in cultures expressing KRASG12V in combination with HUWE1 knockdown. In the same conditions, a drastic reduction of clonogenic capacity (p<0,001), especially of BFU-E colonies, was observed. HUWE1 knockdown also changed differentiation profile to the monocytic lineage. Results suggest that HUWE1 might play a role in leukemogenesis process and differentiation of human HSPCs, acting in the modulation of RAS/RAF/MEK/ERK.

Prostate tumor overexpressed 1 (PTOV1) is highly expressed in several forms of cancer. High expression of PTOV1 is associated with tumor aggressiveness in several tumor types, including ovarian and breast cancer. Currently, PTOV1 is known to act both as a translational and transcriptional regulator aiding in the expression of prosurvival genes. Although PTOV1 is known to pass in and out of the nucleus in a cell cycle-dependent manner, the regulation of PTOV1 activity is not well understood and here we identify 14-3-3 as a PTOV1 interactor and show that high levels of 14-3-3 expression, like PTOV1, correlate with prostate cancer progression. Further, we identify SGK2-mediated phosphorylation at S36 of PTOV1 that is required for 14-3-3 binding. Disruption of the PTOV1-14-3-3 interaction results in an accumulation of PTOV1 in the nucleus and a proteasome-dependent reduction in PTOV1 protein levels, which requires ubiquitination at K114 of PTOV1. We also observed HUWE1 as a PTOV1-interacting partner responsible for the degradation of PTOV1 through the proteasome. We show that loss of 14-3-3 binding leads to an increase in PTOV1-HUWE1 binding, suggesting that 14-3-3 stabilizes PTOV1 protein by sequestering PTOV1 in the cytosol and inhibiting its interaction with HUWE1. Finally, our data suggest that stabilization of the 14-3-3-bound form of PTOV1 promotes PTOV1-mediated expression of cJun. Together, these data support a model that explains how 14-3-3 and HUWE1 regulate the PTOV1 stability, localization, and function within the cell.