As bactérias do gênero Aeromonas são importantes microrganismos aquáticos e agentes causais de doenças infecciosas em animais, inclusive o homem. Sua ampla distribuição em ambientes aquáticos continentais e marinhos é indicativa da sua capacidade de adaptação a distintos níveis de salinidade, fato por sua vez relevante na contaminação de alimentos. A tolerância bacteriana ao estresse salino está associada à manutenção da homeostase celular através de sistemas de transporte de íons e acúmulo de solutos orgânicos, como betaína, prolina, entre outros. A betaína é um osmoprotetor encontrado em plantas, animais e microrganismos sendo transportado em bactérias através de um sistema de transporte do tipo ABC específico codificado pelo operon ProU. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a tolerância ao estresse salino em Aeromonas, incluindo determinar o crescimento e a viabilidade celular em Aeromonas em estresse salino, avaliar a expressão dos genes de transporte de betaína após estresse salino e realizar uma análise in silico do operon proU em bactérias Gram negativas. Os resultados mostram que Aeromonas trota apresenta mais tolerância à salinidade do que Aeromonas hydrophila, sendo que algumas espécies de Aeromonas podem crescer em meio mínimo contendo até 0,42M de NaCl, concentração utilizada como agente de preservação de alimentos. A betaína atua como osmoprotetor em Aeromonas, determinando a sua capacidade de sobrevivência e crescimento em concentrações mais elevadas de cloreto de sódio (0,51 a 0,68M). Por outro lado, a colina, considerada importante precursor da betaína em algumas bactérias, não apresenta efeito osmoprotetor em Aeromonas. Avaliação de pré-crescimento com betaína mostram que este osmoprotetor é acumulado mesmo na ausência de estresse, determinando uma pré-adaptação bacteriana a mudanças de osmolaridade. Análise in silico do operon proU, responsável pelo transporte de betaína, mostra elevada conservação do mesmo em bactérias, indicando a importância deste transportador ABC. Experimentos de expressão do operon proU em A. hdydrophila mostraram expressão constitutiva basal e aumento significativo da expressão do operon proU em bactérias submetidas a estresse osmótico, mesmo na ausência do osmoprotetor. Assim sendo, a expressão do operon proU em A. hydrophila é modulada pelo estresse intracelular, de tal forma que a mesma volta a níveis próximos do basal quando a célula atinge a homeostase. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-16T12:41:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Evanise Visentini.pdf: 1544112 bytes, checksum: 79ad3b4bbbad93df773fea021178cdd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-16T12:41:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Evanise Visentini.pdf: 1544112 bytes, checksum: 79ad3b4bbbad93df773fea021178cdd0 (MD5) / The bacteria from the Aeromonas genus are important aquatic microorganisms and causative agents of infectious diseases in animals, and even to mankind. Its wide distribution in continental aquatic and marine environments is an indicative of its ability to adapt to different levels of salinity, which is a relevant fact concerning food contamination. The bacterial tolerance to saline stress is associated with the maintenance of cellular homeostasis through ion transportation systems and the accumulation of organic solutes, such as betaine, proline, among others. Betaine is an osmoprotectant found in plants, animals and microorganisms, transported in bacteria by a transportation system of the ABC specific type, encoded by operon ProU. In this context, the objectives of this study were: to measure the tolerance to saline stress in Aeromonas, including determining the growth and cell viability in Aeromonas in saline stress, evaluate the expression of betaine transport genes after saline stress and create an in silico analysis of the proU operon in Gram negative bacteria. The results demonstrate that Aeromonas trota present more salinity tolerance than Aeromonas hydrophila, and that some Aeromonas species can grow in minimal environment containing up to 0.42 M of NaCl, concentration used as a food preservative agent. The betaine acts as an osmoprotectant in Aeromonas, determining their capacity to survive and grow in higher concentrations of sodium chloride (0.51 to 0.68 M). On the other hand, the choline, considered as an important betaine precursor in some bacteria, presents no osmoprotectant effect on Aeromonas. The evaluation of pre-growth with betaine show that this osmoprotectant is accumulated even in the absence of stress, determining a bacterial pre-adaptation to changes in osmolarity. The in silico analysis of the operon proU, responsible for betaine transportation, shows their high conservation in bacteria, indicating the importance of this ABC transporter. Expression experiments of the operon proU in A. hdydrophila showed constitutive basal expression and significant increase of the operon proU expression in bacteria exposed to osmotic stress, even in the absence of the osmoprotectant. Therefore, the operon proU expression in A. hydrophila is modulated by intracellular stress, in such manner, that it returns to close baseline levels when the cell reaches homeostasis.

As bactérias do gênero Aeromonas são importantes microrganismos aquáticos e agentes causais de doenças infecciosas em animais, inclusive o homem. Sua ampla distribuição em ambientes aquáticos continentais e marinhos é indicativa da sua capacidade de adaptação a distintos níveis de salinidade, fato por sua vez relevante na contaminação de alimentos. A tolerância bacteriana ao estresse salino está associada à manutenção da homeostase celular através de sistemas de transporte de íons e acúmulo de solutos orgânicos, como betaína, prolina, entre outros. A betaína é um osmoprotetor encontrado em plantas, animais e microrganismos sendo transportado em bactérias através de um sistema de transporte do tipo ABC específico codificado pelo operon ProU. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar a tolerância ao estresse salino em Aeromonas, incluindo determinar o crescimento e a viabilidade celular em Aeromonas em estresse salino, avaliar a expressão dos genes de transporte de betaína após estresse salino e realizar uma análise in silico do operon proU em bactérias Gram negativas. Os resultados mostram que Aeromonas trota apresenta mais tolerância à salinidade do que Aeromonas hydrophila, sendo que algumas espécies de Aeromonas podem crescer em meio mínimo contendo até 0,42M de NaCl, concentração utilizada como agente de preservação de alimentos. A betaína atua como osmoprotetor em Aeromonas, determinando a sua capacidade de sobrevivência e crescimento em concentrações mais elevadas de cloreto de sódio (0,51 a 0,68M). Por outro lado, a colina, considerada importante precursor da betaína em algumas bactérias, não apresenta efeito osmoprotetor em Aeromonas. Avaliação de pré-crescimento com betaína mostram que este osmoprotetor é acumulado mesmo na ausência de estresse, determinando uma pré-adaptação bacteriana a mudanças de osmolaridade. Análise in silico do operon proU, responsável pelo transporte de betaína, mostra elevada conservação do mesmo em bactérias, indicando a importância deste transportador ABC. Experimentos de expressão do operon proU em A. hdydrophila mostraram expressão constitutiva basal e aumento significativo da expressão do operon proU em bactérias submetidas a estresse osmótico, mesmo na ausência do osmoprotetor. Assim sendo, a expressão do operon proU em A. hydrophila é modulada pelo estresse intracelular, de tal forma que a mesma volta a níveis próximos do basal quando a célula atinge a homeostase. / The bacteria from the Aeromonas genus are important aquatic microorganisms and causative agents of infectious diseases in animals, and even to mankind. Its wide distribution in continental aquatic and marine environments is an indicative of its ability to adapt to different levels of salinity, which is a relevant fact concerning food contamination. The bacterial tolerance to saline stress is associated with the maintenance of cellular homeostasis through ion transportation systems and the accumulation of organic solutes, such as betaine, proline, among others. Betaine is an osmoprotectant found in plants, animals and microorganisms, transported in bacteria by a transportation system of the ABC specific type, encoded by operon ProU. In this context, the objectives of this study were: to measure the tolerance to saline stress in Aeromonas, including determining the growth and cell viability in Aeromonas in saline stress, evaluate the expression of betaine transport genes after saline stress and create an in silico analysis of the proU operon in Gram negative bacteria. The results demonstrate that Aeromonas trota present more salinity tolerance than Aeromonas hydrophila, and that some Aeromonas species can grow in minimal environment containing up to 0.42 M of NaCl, concentration used as a food preservative agent. The betaine acts as an osmoprotectant in Aeromonas, determining their capacity to survive and grow in higher concentrations of sodium chloride (0.51 to 0.68 M). On the other hand, the choline, considered as an important betaine precursor in some bacteria, presents no osmoprotectant effect on Aeromonas. The evaluation of pre-growth with betaine show that this osmoprotectant is accumulated even in the absence of stress, determining a bacterial pre-adaptation to changes in osmolarity. The in silico analysis of the operon proU, responsible for betaine transportation, shows their high conservation in bacteria, indicating the importance of this ABC transporter. Expression experiments of the operon proU in A. hdydrophila showed constitutive basal expression and significant increase of the operon proU expression in bacteria exposed to osmotic stress, even in the absence of the osmoprotectant. Therefore, the operon proU expression in A. hydrophila is modulated by intracellular stress, in such manner, that it returns to close baseline levels when the cell reaches homeostasis.

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

Submitted by Michel Ricardo Gracioli (michel-rg@hotmail.com) on 2018-04-17T15:51:19Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Michel.pdf: 1706772 bytes, checksum: 1d66fae75b86a68d89ec8bceca0d2f31 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-04-18T14:13:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gracioli_mr_me_rcla.pdf: 1697470 bytes, checksum: 82696e96fe2dfed0fbd786c7230a8994 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-18T14:13:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gracioli_mr_me_rcla.pdf: 1697470 bytes, checksum: 82696e96fe2dfed0fbd786c7230a8994 (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As enzimas xilanases são de grande interesse biotecnológico em função da sua habilidade na degradação da molécula de xilana, a principal hemicelulose presente na parede celular de plantas. Tais enzimas encontram aplicações nos mais diversos ramos da indústria como na produção de alimentos e bebidas, de cosméticos, de ração animal, de biocombustíveis entre outros. Em razão da sua composição química, os subprodutos lignocelulósicos, produzidos em grande quantidade pela agroindústria, se apresentam como uma potencial fonte sustentável para a produção de valiosos compostos como biocombustíveis, fertilizantes, rações, produtos químicos e enzimas. Assim, tendo em vista esse contexto, foi desenvolvido o presente trabalho, cujo objetivo foi caracterizar e purificar a principal endoxilanase produzida por uma linhagem de Aspergillus hortai cultivado em estado sólido e aplicá-la, nas formas bruta e purificada, na hidrólise de subprodutos agroindustriais. A purificação da enzima foi alcançada após três etapas cromatográficas, respectivamente, uma cromatografia de troca iônica seguida por cromatografias de interação hidrofóbica e exclusão molecular. Ao final das etapas, a enzima purificada apresentou recuperação de 1,1% e fator de purificação de 15,8 vezes. A enzima bruta e purificada se mostrou tolerante ao NaCl na presença de até 4 M do sal. Por outro lado, foi pouco tolerante à presença de íons e alguns compostos como Hg2+, Cu2+, SDS, Triton X-100 e TWEEN 20/80. Em contrapartida, DTT e β-mercaptoetanol a 10 mM estimularam a atividade da enzima bruta em 13 e 19%, respectivamente. Para a enzima bruta, a temperatura e pH ótimos de reação foram, respectivamente, 60 °C e 6,0 tanto na ausência quanto na presença de NaCl 0,5 e 2,5 M. Apresentou boa estabilidade térmica a 40 °C na ausência de NaCl, e foi ativada na presença de 0,5 M e 2,5 M do sal durante as 4 h de incubação. A enzima bruta e purificada foi estável em uma ampla faixa de pHs (3,0-8,0) na ausência e na presença de NaCl e apresentou alta especificidade pelas xilanas birchwood, beechwood e oat spelt, não tendo sido detectadas atividades endoglucanase sobre CMC, exoglucanase em Avicel e β-xilosidase em ρNPX. Após a purificação, os perfis de temperatura e pH ótimos de reação se mantiveram em 60 °C e 6, respectivamente. A enzima pura foi, também, bastante estável a temperatura de 40 °C, mantendo mais de 50% da atividade controle durante as 4 h de incubação, e ao pH, variando de 3,0-8,0, na ausência e na presença de NaCl. Xilobiose e xilo-oligossacarídeos superiores foram os produtos formados na hidrólise da xilana oat spelt pela enzima purificada, sugerindo ação enzimática do tipo endoxilanase. A massa molecular aparente, após a purificação, foi estimada em 25,0 kDa por SDS-PAGE e em 14,8 kDa por exclusão molecular. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx em xilana de beechwood sofreram variações em resposta a presença de NaCl, sendo a maior eficiência catalítica obtida na presença de 2,5 M do sal (kcat/km 40,91). A análise da composição química dos subprodutos - sabugo, palha e folha de milho - revelou, respectivamente, 25,6%, 45,3% e 34,9% de carboidratos, 19,7%, 15,2% e 17,6% de lignina e 9,0%, 17,4% e 24,0% de extrativos para a biomassa in natura e, 33,3%, 25,2% e 38,8% de carboidratos e 6,5%, 8,9% e 12,3% de lignina para a xilana extraída desses subprodutos. A extração das hemiceluloses utilizando tratamento alcalino oxidativo resultou em um rendimento de 64% para o sabugo, 18% para a palha e 50% para a folha. A enzima bruta e purificada foi capaz de hidrolisar as biomassas na forma in natura, bem como as xilanas extraídas desse material produzindo majoritariamente xilopentoses e xilohexoses. Sendo assim, pode-se afirmar que a xilanase bruta e purificada em estudo apresentou propriedades interessantes para a aplicação industrial, especialmente na produção de xilo-oligossacarídeos e em processos conduzidos sob elevada salinidade. / Xylanases raise a biotechnological interest due to its ability to degrade xylan. Such enzymes find use in a variety of industrial processes such as the production of food and beverage, cosmetics, animal feed, second generation ethanol, among many others. As for its chemical composition, lignocellulosic byproducts, widely produced by agroindustry, presents itself as a potential sustainable source for production of valuable composts like soil fertilizers, animal feed, chemical products and enzymes. In this context, the main xylanase produced by an Aspergillus hortae strain, cultivated in solid state (SSF), was characterized, purified and applied in the hydrolysis of hemicellulose from corn by-products. Enzyme purification was achieved after three chromatographyc steps, respectively, an ion exchange chromatography followed by hydrophobic interaction and molecular exclusion chromatographys. After the purification steps, a final yield of 1.1% and purification fold of 15.8 was achieved. Both crude and purified enzyme showed high tolerance to NaCl in the presence of up to 4 M of the salt. The enzyme displayed a very low tolerance to some metal ions and chemical compounds, especially Hg2+, Cu2+, SDS, Triton X-100 and TWEEN 20/80. On the other hand, DTT and β- mercaptoetanol at 10 mM stimulated crude enzyme activity in 13% and 19%, respectively. As for the crude enzyme, optimum temperature and pH were, respectively, 60 °C and 6.0, in the absence and presence of 0.5 and 2.5 M NaCl. It showed good thermal stability at 40 °C in the absence of NaCl and was activated in the presence of 0.5 and 2.5 M of the salt throughout the 4 h incubation time. Crude and purified enzyme was also stable over a wide pH range (3.0 - 8.0) both in the absence and presence of NaCl and presented high specificity for birchwood, beechwood and oat spelt xylans, not showing detectable endoglucanase, exoglucanase and β- xylosidase activities. After purification, optimum temperature and pH profiles remained at 60 °C and 6.0, respectively. Purified enzyme showed good stability at 40 °C, being able to retain more than 50% of the control activity during 4 h of incubation, and to the pH, varying from 3.0 to 8.0, in the absence and in the presence of NaCl. Xylobiose and xilooligosaccharides were the products of oat spelt xylan hydrolysis by the purified enzyme, suggesting an endoxilanase mode of action. The apparent molecular mass, after purification, was estimated to be 25.0 kDa by SDS-PAGE and 14.8 kDa by exclusion chromatography. Kinetic parameters of Km and Vmáx using beechwood xylan were 5.12 mg/mL and 14.25 μmol/min.mL, respectively, in the absence of NaCl, 9.56 mg/mL and 20.80 μmol/min.mL in the presence of 0.5 M and 3.13 mg/mL and 9.22 μmol/min.mL in the presence of 2.5 M of the same salt. Chemical analysis of the biomasses from corn cob, stover and leaves, revealed a composition of, respectively, 25.6%, 45.3%, 34.9% carbohydrates, 19.7%, 15.2%, 17.6% lignin and 9.0%, 17.4%, 24.0% extractives for in natura biomasses and 33.3%, 25.2%, 38.8% carbohydrates and 6.5%, 8.9%, 12.3% lignin for the extracted hemicelluloses. Hemicellulose extraction yields were of 64% for corn cob, 18% for stover and 50% for leaves. Both crude and purified enzyme was capable of hydrolyzing in natura biomasses, as well as the extracted hemicelluloses from these materials, producing mainly xylopentoses and xyloheoses. In summary, the xylanase presented attractive properties for industrial applications, especially in the production of xyloolygossacharides and in those carried out under high NaCl concentration. / CNPq: 130841/2016-1.

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

A fim de garantir a viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração é necessário o desenvolvimento de tecnologias eficientes para a hidrólise enzimática dos materiais lignocelulósicos. Além disso, o elevado consumo de água pelas biorrefinarias tem despertado grande atenção para a utilização de recursos hídricos não-potáveis, como a água do mar. Assim, atualmente busca-se por enzimas tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos gerados e/ou acumulados nas etapas de pré-tratamento da biomassa. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi a purificação e caracterização cinética e bioquímica de uma ß-xilosidase produzida por uma linhagem do fungo mesófilo Colletotrichum graminicola. A enzima purificada (Bxcg) apresentou conteúdo de carboidratos totais de 54% (m/m), ponto isoelétrico de 4,2 e uma massa molecular aparente de cerca de 130 kDa, que foi reduzida para cerca de 92 kDa após deglicosilação. A enzima mostrou boa tolerância a elevadas concentrações de sal e manteve cerca de 90% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol L-1 (concentração média de NaCl na água do mar). A temperatura e pH ótimos de reação foram 65 ºC e 4,5, respectivamente, tanto na ausência quanto na presença de NaCl 0,5 mol L-1. Já na presença de NaCl 2,5 mol L-1 o pH ótimo de atividade foi alterado para 5,0. Bxcg permaneceu estável numa ampla faixa pH (4,0 - 7,5) tanto na ausência quanto na presença de sal. A enzima mostrou ótima estabilidade térmica e manteve completamente estável à 50 ºC após 24 horas de incubação. A presença de elevada concentração de NaCl (2,5 mol L-1) resultou num aumento na termoestabilidade da enzima. A atividade enzimática foi tolerante aos íons Ca2+, Sr2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Mn 2+, Mg2+, K+ e Na+. Na ausência de sal, Bxcg hidrolisou p-nitrofenil-?-D-xilopiranosídeo (pNP-XIL) com Vmáx de 348,8 ± 11,5 U mg-1, KM de 0,52 ± 0,02 mmol L-1 e alta eficiência catalítica (kcat/KM = 1432,7 ± 47,3 L mmol-1 s-1). Em presença de sal, a afinidade aparente de Bxcg pelo substrato foi levemente menor e a hidrólise ocorreu com Vmáx menor, resultando em eficiência catalítica cerca de 1,5 de vezes menor, se comparadas as condição de ausência de sal. A enzima apresentou atividade bifuncional de ?-xilosidase/?-L-arabinofuranosidase. Bxcg hidrolisou p-nitrofenil-?-L-arabinopiranosídeo com afinidade aparente cerca de 18 vezes menor (KM = 9,6 ± 0,5 mmol L-1) que a estimada para pNP-XIL e a hidrólise do substrato ocorreu com Vmáx de 148,4 ± 4,4 U mg-1 e eficiência catalítica de 33,1 ± 1,6 L mmol-1 s-1. A enzima foi fortemente inibida por xilose com KI de 3,3 mmol L-1. Bxcg foi capaz de hidrolisar xilooligossacarídeos até xilohexaose, inclusive aqueles com ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. Bxcg e uma endo-xilanase purificada do mesmo microrganismo apresentaram um forte efeito sinérgico (3,1 vezes) para hidrólise de xilana beechwood. A enzima mostrou-se tolerante aos solventes butanol, glicerol, tolueno e acetona, bem como aos surfactantes Triton X-100, Tween 80 e Tween 20, enquanto que o líquido iônico acetato de 1-etil-3-metilimidazólio inibiu fortemente a atividade enzimática. De uma maneira geral, Bxcg apresenta propriedades atraentes para a aplicação em processos de sacarificação da biomassa lignocelulósica, incluindo aqueles conduzidos em elevada salinidade e/ou em presença de compostos residuais gerados ou acumulados nas etapas de pré-tratamento da biomassa / In order to ensure the economic viability of the production of second-generation ethanol, it is necessary the development of efficient technologies for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials. In addition, the large consumption of water by biorefineries has attracted great attention for the use of non-potable water resources, such as seawater. Therefore, enzymes tolerant to high salt concentrations and the by-products generated and/or accumulated in the biomass pretreatment steps are widely studied. In this context, the objective of this study was the purification and kinetic and biochemical characterization of a ?-xylosidase produced by a strain of the mesophilic fungus Colletotrichum graminicola. The pure enzyme (Bxcg) showed a total carbohydrate content of 54% (w/w), isoelectric point of 4.2 and an apparent molecular weight of 130 kDa, which was reduced to 92 kDa after deglucosylation. The enzyme showed good tolerance to high salt concentrations and retained aproximately 90% of the control activity in the presence of 0.5 mol L-1 NaCl (NaCl concentration in seawater). The optimum reaction temperature and pH were 65 °C and 4.5, respectively, both in the absence and presence of 0.5 mol L-1 NaCl. In the presence of 2.5 mol L-1 NaCl, the optimum pH was altered to 5.0. Bxcg retained stable over a wide pH range (4.0 - 7.5) both in the absence and presence of salt. The enzyme showed excellent thermal stability and retained completely stable at 50 °C after 24 hours of incubation. The presence of high NaCl concentration (2.5 mol L-1) resulted in an increase in the thermostability of the enzyme. The enzymatic activity was tolerant to Ca2+, Sr2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Mn2+, Mg2+, K+ and Na+. In the absence of salt, Bxcg hydrolyzed p-nitrophenyl-?-D-xylopyranoside (pNP-XIL) with Vmax of 348.8 ± 11.5 U mg-1, KM of 0.52 ± 0.02 mmol L-1 and high catalytic efficiency (kcat/KM = 1432.7 ± 47.3 L mmol-1 s-1). In the presence of salt, the apparent affinity for the substrate was slightly lower and the hydrolysis occurred with smaller Vmax, resulting in catalytic efficiency 1.5 fold lower, when compared to the salt. The enzyme showed bifunctional ?-xylosidase/?-L-arabinofuranosidase activity. Bxcg hydrolyzed p-nitrophenyl-?-L-arabinopyranoside with apparent affinity 18-fold lower (KM = 9.6 ± 0.5 mmol L-1) than that estimated for pNP-XIL and substrate hydrolysis occurred with Vmax of 148.4 ± 4.4 U mg-1 and catalytic efficiency of 33.1 ± 1.6 L mmol-1 s-1. The enzyme was strongly inhibited by xylose with KI of 3.3 mmol L-1. Bxcg was able to hydrolyze xylooligosaccharides from xylohexaose, including those with 4-O-methyl-glucuronic acid branch. Bxcg and a pure endo-xylanase from the same microorganism had a strong synergistic effect (3.1 fold) for hydrolysis of xylan beechwood. The enzyme was tolerant to the butanol, glycerol, toluene and acetone solvents, as well as the Triton X-100, Tween 80 and Tween 20 surfactants, whereas the 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ionic liquid strongly inhibited the enzymatic activity. In summary, Bxcg has attractive properties for application in saccharification processes of the lignocellulosic biomass, particularly under high salinity and/or in the presence of residues of biomass pretreatment steps