Blood vessels convert arachidonic acid to prostacyclin (PGI(,2)), which is a potent inhibitor of platelet aggregation and thrombus formation. Polyunsaturated fatty acids (PUFA) or their hydroperoxy metabolites can cause a reduction in PGI(,2) production. Therefore, in the present study, the metabolism of PUFA and their effects on PGI(,2) production have been investigated. / Linoleic acid is converted by aorta to hydroperoxy metabolites, which are either dehydrated to oxo compounds, reduced to monohydroxy products, or converted to epoxyhydroxy-octadecenoic acids. The latter are then hydrolyzed to trihydroxy metabolites by aortic epoxide hydrolases. Aorta also converts eicosatrienoic acid to similar products, which are formed via 12-hydroperoxy-8,10-heptadecadienoic acid. / GC-MS analysis indicated that the major oxygenated PUFA metabolite formed by rat and bovine blood vessels was 6-oxoprostaglandin-F(,1(alpha)). Substantial amounts of free and esterified monohydroxy and trihydroxy metabolites of linoleic acid were detected, especially in rat and rabbit aortae. Reduction of glutathione peroxidase activity by administration of a selenium-deficient diet had no significant effect on the formation of any of the above products. / The presence of esterified monohydroxy and trihydroxy PUFA metabolites in aortic lipids indicates that their esterified hydroperoxy precursors are present. An excess of these products could inhibit PGI(,2) synthesis and contribute to the onset of atherosclerosis.

The role of prostanoids in autoregulation of cerebral blood flow (CBF) of the newborn is unclear. We hypothesized that prostanoids not only exhibit cerebral vasoactive properties, but also play an important role in setting the limits of autoregulation of CBF in the newborn. / Consequently, in the newborn piglet, we determined the effects of prostaglandins (PGs), PGE$ sb1$, PGE$ sb2$, PGF$ sb{2 alpha}$ and PGI$ sb2$, on CBF, and compared their vasoactive action on isolated internal carotid and basilar arteries of newborns and adults. Cerebrovascular prostanoid concentrations were also measured as a function of systemic blood pressure (BP), in animals subjected or not to prostanoid synthesis inhibition, using ibuprofen. Finally, we examined in the preterm infant the effects of indomethacin on CBF velocity (CBFV) during clinical procedures (endotracheal suctioning) known to increase BP and CBFV concomitantly. / All major cerebrovascular PGs (physiologically relevant doses) increased CBF, and contracted minimally isolated arteries. These effects were most evident for PGF$ sb{2 alpha}$, the most effective adult vasoconstrictor PG. / During hypotension, sagittal sinus concentrations of thromboxane exhibited the highest increase of all prostanoids. However, during hypertension, PGE, PGF$ sb{2 alpha}$, and 6-keto-PGF$ sb{1 alpha}$ increased, without changes in TXB$ sb2$. Ibuprofen, inhibited the changes in prostanoids that occurred as a function of BP, and widened CBF autoregulation from 50-90 mm Hg to 35-117 mm Hg of BP. Therefore, the potent vasoconstrictor, thromboxane, contributed to set the lower limit of the CBF autoregulatory range to 50 mm Hg of BP; and PGs (which increase newborn CBF) contributed to the pressure-passivity of CBF above 90 mm Hg. / In the preterm newborn infant, indomethacin attenuated the increases in CBFV that occur with endotracheal suctioning; thus, in accord with studies on animals subjected to changes in BP. / In conclusion, PGs possess minimal cerebral vasocontractile activity in the newborn. The findings confirm our hypothesis that prostanoids contribute significantly in establishing the range of CBF autoregulation of the newborn, which is principally narrowed at its upper limit compared to that of the adult. Thus, the difference in the CBF autoregulatory range of the newborn and adult animal appears to result mainly from age-related differences in the effects of PGs on cerebral hemodynamics. Finally, ibuprofen may provide therapeutic modes to prevent hemorrhagic and ischemic encephalopathies of the newborn.

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Atrial fibrillation (AF) is the most common sustained arrhythmia encountered in clinical practice. The objectives of this study were to determine the mechanisms and significance of ionic transients in mathematical action potential models, determine the relative contributions of tachycardia-related myocyte remodeling processes to the pathologic features of the remodeled action potential, and to investigate mechanisms of AF maintenance and antiarrhythmic drugs in atrial tissue. / We began by formulating expressions for myocyte Cl- transport processes which allowed us to evaluate model stability and the influence of model equation singularity, and to characterize pacing-induced ionic transients. We found that tissue and model transients are comparable, indicating that any distortion arising from dynamic equation instabilities is not likely to be significant. / We then measured Ca2+-transients in isolated atrial myocytes in control and following tachycardia-induced remodeling and formulated the first atrial action potential model with realistic Ca2+-handling properties. Our results demonstrate that both remodeling of sarcolemmal ionic currents and subcellular Ca2+-handling processes contribute significantly to action potential shortening and loss of rate adaptation as occurs in chronic AF. / Next we developed a two-dimensional model of canine atrial tissue and the first model of AF with realistic ionic and propagation properties. The model provides the first theoretical confirmation of the recent experimentally-determined conception of the mechanisms of AF maintenance, indicating that discrete "driver regions" underlie AF, and that wavelets generated by emanating wavefronts give rise to fibrillation but play a relatively passive role in maintaining AF. / Finally we used our model of AF to determine the mechanisms of AF termination by sodium channel blocking agents (class I antiarrhythmic drugs). In agreement with recent experimental findings, our results demonstrate how sodium channel inhibition first slows and organizes AF, and how the effects of decreased excitability cause AF termination in a way that is independent of wavelength changes, previously thought to be necessary for antiarrhythmic efficacy. (Abstract shortened by UMI.)

Androgens, in particular dihydrotestosterone (DHT), are crucial for maintaining the structure and functions (sperm maturation and storage) of the epididymis. DHT is synthesized from testosterone by steroid 5alpha-reductase (Srd5aR) type 1 and type 2. Srd5aR1 and srd5aR2 have different tissue-specific distribution patterns and distinct genetic and biochemical properties. Srd5aR2 mRNA is more abundant than that of srd5aR1 in several sex accessory tissues, most dramatically in the epididymis, where it is predominantly expressed in the caput region. / The two main objectives of this thesis are to elucidate the transcriptional and epigenetic regulation of srd5aR2 in the rat epididymis and to identify androgen-dependent genes in epididymal principal cells. / In the first objective, the 5'upstream region of srd5aR2 was cloned and analyzed. The gene's transcriptional start site was localized, regulatory elements and the core promoter were mapped, and the transcription factors SP1, and to a lesser extent SP3, were found to interact with srd5aR2 in the rat caput epididymidis and mouse proximal caput epididymidis (PC-1) cell line. The epigenetic regulation of srd5aR2 by DNA methylation was subsequently examined and contrasted to that of srd5aRl in tissues where the isozymes are differentially expressed. DNA methylation levels fluctuated along the 5'upstream region of both genes. Tissue-specific variations in adenine and cytosine methylation were also identified for srd5aR1 and srd5aR2, respectively. These studies constitute the first analysis of the 5'upstream region of srd5aR2, at both the transcriptional and epigenetic levels. / In the second objective, the direct effects of androgens on principal cell gene expression were examined in PC-1 cells. The majority of androgen-regulated genes displayed an early or late transient increase in expression levels following androgen withdrawal. When DHT was added back to the media, a differential ability of rescue was seen among androgen-regulated genes depending on time of supplementation. This rescue ability was severely compromised after 4 days of androgen deprivation. These results provide novel insights into the response of principal cells to androgens. / Together, the two objectives of this thesis impart greater understanding into the mechanisms of androgen action in the epididymis.

Deterioration of cognitive functions including a profound loss of memory is one of the early clinical symptoms observed in Alzheimer disease (AD). In light of this, a transgenic rat of AD-like amyloid pathology was generated and characterized to better comprehend the pathological mechanisms involved in the memory loss process. The resulting transgenic model expressing a single human mutated form of APP and only one transgene copy per allele was sufficient to trigger the full Aβ amyloid pathology in this rat model. These AD tg rats developed intracellular Aβ accumulation and plaque deposition along with age-pathology-dependent cognitive impairments. In this model the cognitive deficits were found to correlate with the levels of soluble Aβ oligomers; reinforcing the role for Aβ in driving these impairments. A compromise of the emotional behavior is also present early in AD. To determine whether emotional disturbances are also present in this novel rat transgenic model, a fear conditioning protocol was established and applied. These preliminary studies revealed auditory fear memory impairments in young AD transgenic rats which were coincidental with intracellular Aβ accumulation in the amygdala. These findings confirmed the participation of this CNS region in the emotional component of the Aβ-amyloid driven pathology. Finally, strategies were designed to investigate the complete learning and memory mechanisms in naïve and AD tg rats. Thus, we found an increase of ERK phosphorylation in mPFC during spatial memory consolidation and retrieval, supporting the role for ERK activation in the development of spatial memory. In addition we investigated whether the cognitive deficits during spatial memory recall in AD transgenic rats were due to an ERK/MAPK dysregulation in the mPFC. We have found that ERK phosphorylation was markedly deregulated in the mPFC of tg animals following spatial memory recall. In conclusion our studies have resulted in the characterization of a novel transgenic rat, a species with superior cognitive functions as compared with the traditional mouse transgenic models. In addition we have developed methodologies for the investigation of the ERK-regulated cell signalling in the hippocampus and mPFC showing a participation of this region in memory consolidation and recall and lastly we have obtained solid preliminary information on the participation of amygdala in the emotional involvement provided by the Aβ amyloid pathology. / La détérioration des fonctions cognitives incluant des pertes de mémoire est un des premiers symptômes cliniques observés dans la maladie d'Alzheimer (AD). Pour des fins de recherche, un modèle de rats transgéniques de la pathologie amyloïde similaire à AD a été généré et caractérisé afin de mieux comprendre les mécanismes pathologiques impliqués dans les troubles de la mémoire. Ce modèle transgénique exprime une seule copie de la version mutée de la protéine humaine APP et une seule copie par allèle est suffisante pour déclencher la pathologie amyloïde Aβ. Ces rats transgéniques accumulent l'Aβ intracellulaire, des plaques extracellulaires ainsi que des troubles cognitifs au fil de l'avancement pathologique. Dans ce modèle, les troubles cognitifs corrélaient avec les niveaux d'Aβ soluble oligomérique, soulignant le rôle d'Aβ dans ces altérations cognitives. En plus de la mémoire, le comportement émotif est aussi affecté par l'AD. Afin de déterminer si ces troubles émotifs sont aussi présents dans ce nouveau modèle de rats transgéniques, nous avons calibré et utilisé un protocole de conditionnement de la peur. Ces études préliminaires ont démontré un trouble de conditionnement de la peur au son chez les jeunes animaux transgéniques qui coïncidait avec de l'accumulation intraneuronale d'Aβ dans l'amygdale. Ces résultats ont confirmé la participation de cette région du SNC dans la partie émotive de la pathologie de l'Aβ. Finalement, nous avons élaboré des stratégies pour étudier les mécanismes d'apprentissage et de la mémoire chez les rats normaux et transgéniques. Nous avons ainsi trouvé une augmentation des niveaux de phosphorylation de ERK dans le mPFC lors de la consolidation et le rappel de la mémoire, supportant le rôle de l'activation de ERK dans le développement de la mémoire spatiale. De plus, nous avons cherché à savoir si les troubles du rappel de la mémoire chez les rats transgéniques étaient causés par un dérèglement de ERK/MAPK dans le mPFC. Nos résultats démontrent que la phosphorylation d'ERK est déréglée dans le mPFC des animaux transgéniques après le rappel de la mémoire. En conclusion, nos études ont mené à la caractérisation d'un nouveau modèle de rats transgéniques, une espèce avec des aptitudes cognitives supérieures aux modèles plus communs de souris transgéniques. De plus, nous avons développé une méthodologie pour étudier le signalement d'ERK dans l'hippocampe et le mPFC et démontré l'implication de ces régions dans la consolidation et le rappel des mémoires spatiales. Finalement, nous avons obtenu de l'information préliminaire sur la participation de l'Aβ dans l'amygdale causant des troubles émotifs reliés à la pathologie.

The epididymis is a single, highly convoluted tubule linking the efferent ducts of the testis to the vas deferens. It is the site where sperm mature, acquiring forward motility and fertilizing ability. Spermatozoal maturation is the result of complex, dynamic interactions between spermatozoa and the highly specialized, continuously changing luminal microenvironment established by the epididymal epithelium. Regionalized gene expression is paramount to the establishment of this microenvironment. The goal of this thesis was to examine the ID family of transcriptional regulators in the epididymis and their role in male-mediated reproduction. The first objective was to establish the longitudinal expression profiles and cellular distribution of the four IDs along the epididymis and how expression was affected by orchidectomy and by aging. IDs display unique longitudinal expression profiles along the tissue, having highly regionalized expression, and are primarily expressed in non-overlapping cell types. While aging resulted in no noticeable effect, we observed that the expression of ID3 is differentially regulated in response to orchidectomy along the tissue. The next objective was to determine the functional consequences of Id3 deficiency (Id3tm1Cmu/Id3tm1Cmu) on epididymal histology and gene expression, as well as spermatozoal counts and motility parameters. Although Id3 deficiency had no noticeable impact on epididymal histology, the targeted mutation altered several sperm motility parameters. We undertook genome-wide expression profiling to elucidate region-specific effects and found that the predominant effect of the Id3 null mutation is in the cauda epididymidis, where the expression of many transcription factors was significantly affected. The final objective was to assess the fertility status and progeny outcome of animals deficient in Id3. Matings with Id3-/- males resulted in abnormal reproductive outcomes and developmental phenotypes in gestational day 18 fetuses. These were characterized by an elevated rate of fetal death, reduced body weights of live fetuses, a higher rate of external malformations, and aberrant skeletal development. Collectively, these studies indicate that Id3 may contribute to the molecular basis of regionalized gene expression in the epididymis, provide novel insights into the role of Id3 in male-mediated reproduction, and afford new perspectives for future avenues of research. / L'épididyme est un tubule unique, replié maintes fois sur lui-même, reliant les canaux efférents des testicules au canal déférent. L'épididyme est le site de maturation des spermatozoïdes; là où ils acquièrent leur mobilité et leur habileté à fertiliser. Cette maturation est le résultat d'une dynamique complexe d'interactions entre les spermatozoïdes et un microenvironnement hautement spécialisé, continuellement entretenu par l'épithélium de l'épididyme. L'expression régionalisée des gènes de cet organe est primordiale pour le maintien de ce microenvironnement. Le but de ces travaux de thèse était d'étudier la famille des régulateurs de transcription que sont les inhibiteurs de liaison à l'ADN (IDs), dans l'épididyme ainsi que leur rôle en reproduction mâle. Le premier objectif, était d'établir le profil d'expression longitudinal et cellulaire des IDs dans l'épididyme et d'observer comment l'orchidectomie et l'âge pouvaient affecter ces profils d'expression et de localisation. Les protéines IDs montrent une expression longitudinale unique le long du tissu, un profil régionalisé précis, et sont exprimées dans des cellules différentes. Alors que l'âge ne montre aucun effet notable, nous avons observé que l'expression de la protéine ID3 est modifiée après orchidectomie dans l'ensemble de l'épididyme. Le second objectif était de déterminer les conséquences fonctionnelles d'une déficience en ID3 (Id3tm1Cmu/Id3tm1Cmu) sur l'histologie et sur les profils d'expression génétique de l'épididyme, ainsi que les paramètres de numération et de mobilité des spermatozoïdes. Bien que la déficience en ID3 n'ait aucun impact histologique, la mutation affecte les paramètres de mobilité des spermatozoïdes. Pour élucider l'effet de la mutation sur le profil régionalisé d'expression des gènes, nous avons entrepris une analyse du profil d'expression génomique et avons mis en évidence que l'effet de la mutation prédomine dans la partie caudale de l'épididyme, là où l'expression de plusieurs facteurs de transcription était affectée. Enfin, le dernier objectif était d'évaluer la fertilité et la descendance des animaux déficients en ID3. La descendance des souris mâles Id3-/- et leurs phénotypes développementaux sont anormaux. Ces derniers étant caractérisés par un taux élevé de mort fœtale, un poids de naissance faible, un taux de malformations externes anormalement haut, et un développement du squelette anormal. L'ensemble de ces études indique que ID3 contribuerait à la base moléculaire de l'expression régionalisée des gènes de l'épididyme, fournit de nouvelles données sur le rôle de ID3 en reproduction chez le mâle, et offre de nouvelles perspectives pour de futures pistes de recherche.

Background: Ischemic proliferative retinopathies as characterized by an exaggerated retinal neovascularization, are the major cause of visual impairment and blindness in children. Vascularization is essential for development and restoration of tissue integrity following an ischemic injury. Because vascular supply is coupled to tissue energy consumption, a role for metabolic intermediates such as lactate in angiogenesis is conceivable. Moreover, increase in lactic acid production has long been associated with angiogenesis in tumors. Given the recent identification of a novel G-protein coupled receptor for lactate (GPR81) and our detection of high levels of lactate in ischemic retina, we investigated the propensity of lactate to regulate retinal vessel growth via GPR81.Hypothesis: We hypothesized that lactate may play an important role in the development of ischemia-induced retinal neovascularization by acting through specific cognate receptor GPR81. Methods: Lactate levels were measured by a colorimetric assay in retinas of mice exposed to oxygen-induced retinopathy (OIR) model. GPR81 mRNA was analyzed by RT-PCR in the retina of mice exposed to OIR and in Retinal Ganglion Cells (RGC) and retinal endothelial cell cultures. GPR81 protein localization was evaluated by co-immunostaining with cell-specific markers in retinal cryosections. Pro-angiogenic response to lactate was measured in vitro by using endothelial cell tube formation assay and in vivo by analyzing the vascular density in retinal flatmounts of mice pups injected intravitreally with lactate. Results: Lactate concentration increased 2.5 times in the retinas at P17 in animals exposed to OIR model compared to the control. GPR81 mRNA was detected in the mice retina and the cell cultures analyzed. The GPR81 protein was predominantly localized in the ganglion cells, endothelium and Muller Cells in the retina. Lactate showed a pro-angiogenic effect at 10 mM in the endothelial cell assay and a significant increase (p<0.05) in the retinal vascular density. Conclusions: Our result suggest that the pro-angiogenic metabolite lactate produced during neovascularization phase in the OIR model acting via its GPR81 receptor expressed in the retina, may play an important role in the development of vasoproliferative retinopathies. / Contexte: Les rétinopathies ischémiques prolifératives caractérisées par une néovascularisation rétinienne exagérée sont les principales causes de déficience visuelle et de cécité chez les adultes et les enfants. Malgré le rôle important du VEGF dans cette néovascularisation, il existe des preuves que d'autres facteurs participent à ce processus. Notamment des facteurs qui sont sensibles à l'hypoxie-ischémie, les métabolites. Le succinate a été récemment montré comme exerçant un rôle important dans la régulation de l'angiogenèse rétinienne. En outre, l'augmentation de la production d'acide lactique a été associée à l'angiogenèse tumorale. Pour le moment, le rôle du lactate dans le développement des rétinopathies ischémiques n'est pas bien connu. Il a été récemment montré que le lactate exerce ces effets biologiques via un récepteur couplé à une protéine G, le récepteur GPR81. Hypothèse: Nous avons émis l'hypothèse que le lactate peut jouer un rôle important dans le développement de la néovascularisation rétinienne induite par ischémie en agissant par le biais du récepteur GPR81. Méthodes: Les taux de lactate ont été mesurés par un essai colorimétrique dans les rétines de rats soumises au modèle de rétinopathie induite par l'oxygène (RIO). L'ARNm de GPR81 a été analysé par RT-PCR dans les rétines de rats exposés à l'oxygène et dans des cultures de cellules gliales de Müller, de cellules ganglionnaires rétiniennes et de cellules endothéliales rétiniennes. La protéine GPR81 a été localisée sur des cryosections de rétines par un co-immunomarquage avec des marqueurs cellulaires spécifiques. La réponse pro-angiogénique au lactate a été mesurée in vitro en utilisant un test cellulaire de migration de cellules endothéliales et in vivo par analyse de la densité vasculaire dans des montages à plats de rétines de ratons injectés avec du lactate par voie intravitréenne. Résultats: La concentration de lactate est trois fois plus importante dans les rétines des animaux soumis au modèle RIO par rapport aux contrôles sous normoxie. L'ARNm de GPR81 est présent dans la rétine de rat et dans toutes les cellules analysées. La protéine GPR81 est principalement localisée dans les cellules ganglionnaires, endothéliales et de Müller. Le lactate a une concentration de 10 mM montre un effet pro-angiogénique dans le test de migration des cellules endothéliales et augmente significativement (p <0,05) la densité vasculaire rétinienne dans les montages à plats. Conclusions: Nos résultats suggèrent que le lactate est un métabolite pro-angiogénique. Le lactate, produit lors de la phase de la néovascularisation dans le modèle de RIO, joue un rôle important dans le développement des rétinopathies vaso-prolifératives, par l'intermédiaire de son récepteur GPR81

G protein-coupled receptors (GPCRs) play fundamental roles in our homeostatic balance through their involvement in numerous physiological processes. In order to maintain their responsiveness to the extracellular environment, a complex process of receptor desensitization and resensitization has evolved. To allow receptors to be resensitized, they must first undergo endocytosis, a process involving numerous adaptor proteins, which facilitate the internalization of the receptor into the cell. The most common method of GPCR internalization engages the clathrin-dependent pathway, where the two most prominent adaptors are βarrestin and AP-2. While there is a relatively clear picture of how these proteins mediate receptor endocytosis, regulatory mechanisms through which these endocytic adaptors may affect or be affected by signalling events is significantly less well described.The angiotensin II type I receptor is used as the model receptor in our studies, as previous work in our lab characterized some of the protein factors necessary for the endocytic process. While the previous work demonstrated phosphorylation-dependent regulation of βarrestin and AP-2 complex at a putative tyrosine residue, these results were solely in vitro, and had not been confirmed in living cells. As such we generated a polyclonal antibody against this putative phosphorylation site and revealed that not only did this phosphorylation event occur in multiple cell types in response to angiotensin II (AngII) treatment but that the activation of multiple receptors including a non-GPCR, the epidermal growth factor receptor, induced phosphorylation on the β-subunit of AP-2, the main subunit involved in βarrestin binding. My work, which is published in a previous manuscript, also revealed that prevention of this phosphorylation event stabilizes βarrestin/AP-2 complex dramatically. While our initial studies revealed that this phosphorylation event had little impact on receptor endocytosis, new tools have since been developed in the lab. Mainly, we generated a single chain antibody that can be expressed intracellularly targeting the phosphosite, and demonstrated that binding to this phosphorylated residue results in a prolonged endocytic block. We further established this phosphorylated tyrosine residue as a putative binding motif for certain Src homology 2 (SH2) domain containing proteins as three are capable of binding phosphorylated β2adaptin. Finally, due to the βarrestin-dependent nature of this phosphorylation event, we characterized four AngII analogs with single amino acid substitutions in their octapeptide sequence. Our findings established a correlative relationship between the strength of βarrestin to receptor avidity and the level of extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation. Presumably, the differences in avidity would alter the trafficking of the receptor affecting its fate towards recycling or degradation. Furthermore, we establish that the conformation of βarrestin can alter the pathways activated downstream of the receptor resulting in alternative cellular outcomes like cell growth or migration. These results highlight how important regulation of these endocytic adaptors is to overall GPCR fate, not only due to their role in internalization but also for their own signalling potential. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) jouent un rôle fondamental dans notre équilibre homéostatique par leur implication dans de nombreux processus physiologiques. Afin de maintenir leur réactivité à l'environnement extracellulaire, un processus complexe de désensibilisation et resensibilisation des récepteurs a évolué. Afin de permettre aux récepteurs d'être resensibilisés, ils doivent d'abord être internalisés par endocytose, un processus impliquant de nombreuses protéines adaptatrices. La méthode la plus commune de l'internalisation des RCPGs est la voie dépendante à la clathrine, où les deux adaptateurs les plus importants sont βarrestine et AP-2. Bien que nous ayons une image relativement claire de la façon dont ces protéines conduisent à l'endocytose du récepteur, les mécanismes de régulation où ces adaptateurs de l'endocytose peuvent affecter ou être affecté par des processus de signalisation sont nettement moins bien décrits. Le récepteur de l'angiotensine II de type I est utilisé comme récepteur modèle dans nos études. Les études antérieures de notre laboratoire ont caractérisé certains des facteurs protéiques nécessaires pour le processus d'endocytose. Bien que les études précédentes ont démontré une régulation dépendante à la phosphorylation des complexes βarrestine et AP-2, ces résultats ont été exclusivement in vitro et n'ont pas été confirmés dans les cellules vivantes. Nous avons généré un anticorps polyclonal dirigé contre le site de phosphorylation putatif et avons révélé que non seulement cet évènement de phosphorylation se produit dans plusieurs types de cellules en réponse au traitement à l'angiotensine II (AngII), mais que l'activation de récepteurs multiples, comprenant un non-RCPG, le récepteur du facteur de croissance de l'épiderme, induisait la phosphorylation sur l'unité β de AP-2. Mon travail, précédemment publié dans un manuscrit, a également révélé que la prévention de cet évènement de phosphorylation stabilise les complexes βarrestine/AP-2 de façon significative. Bien que nos études initiales aient révélé que cette phosphorylation a peu d'impact sur l'endocytose des récepteurs, de nouveaux outils ont depuis été développés dans le laboratoire. Premièrement, nous avons généré un anticorps à chaîne unique qui peut être exprimé de façon intracellulaire et cible les phosphosites, et avons démontré que la liaison à ce résidu phosphorylé résulte dans un arrêt prolongé de l'endocytose. Nous avons également démontré que ce résidu tyrosine phosphorylé est un motif putatif de liaison pour certaines protéines contenant un domaine SH2 étant donné que trois de ces protéines sont capables de se lier à une β2adaptine phosphorylée. Enfin, en raison de la nature dépendate à βarrestine de cet évènement de phosphorylation, nous avons characterise quatre analogies de AngII avec une seule substitution d'acide amine dans leur sequence octapeptidique. Nos conclusions établissent une relation corrélative entre la force d'avidité de βarrestine pour son récepteur et le niveau d'activation de la kinase ERK suite aux signaux extracellulaires. Vraisemblablement, les différences d'avidité modifient le trafic du récepteur dans son destin vers le recyclage ou la dégradation. Par ailleurs, nous établissons que la conformation de βarrestine peut altérer les voies activées en aval du récepteur, entraînant d'autres effets cellulaires comme la croissance cellulaire ou la migration. Ces résultats mettent en évidence l'importance de la régulation par ces adaptateurs de l'endocytose sur le destin du RCPG, non seulement par leur rôle dans l'internalisation, mais aussi par leur propre potentiel de signalisation.

Beta2-adrenergic receptors (beta2ARs) are predominantly expressed in cardiomyocytes and regulate cardiac contractility. Prolonged stimulation of these receptors can cause detrimental as well as beneficial effects during heart failure. The ability to transduce these different signals is thought to occur via their association into specific multiprotein complexes containing specific set of heterotrimeric G proteins, effectors, and several other interacting partners that modulate their biosynthesis, signalling, and trafficking. The initial interaction of components comprising these signalling complexes occurs at the level of the endoplasmic reticulum (ER) and at present many of the proteins and processes mediating their assembly remain unknown. In order to identify these proteins and candidate processes, we developed a novel proteomic approach for beta2AR purification. We validated this approach by detecting several known interacting partners of beta2AR in HEK 293 cells including adenylyl cyclase 3, N-ethylmaleimide-sensitive factor, ubiquitin, Na+/H+ exchanger regulatory factor 2 (NHERF2) and of course heterotrimeric G proteins. In addition, we identified and confirmed VCP, gp78 and RNF5, proteins related to ER-associated degradation (ERAD), as novel interacting partners of beta2AR. We demonstrated that VCP retrotranslocates beta2AR from ER to the cytosol and the receptor is degraded by the cytosolic proteasome. Proteasome inhibition or VCP knockdown decreased receptor interaction with Gbetagamma and led to an enhanced signalling response via ERK1/2. We conclude that ERAD specifically regulates levels of uncomplexed beta2ARs to Gbetagamma thus has a previously uncharacterized role in quality control of signalling complex assembly. A better understanding of this process might lead to novel therapeutic strategies during clinical conditions such as heart failure where the nature of receptor signalling complexes changes dramatically. / Les récepteurs beta2-adrénergiques (beta2ARs) sont exprimés majoritairement dans les cardiomyocytes et régulent la contractilité myocardique. Lors d'insuffisance cardiaque congestive, la stimulation prolongée de ces récepteurs peut provoquer des effets bénéfiques mais aussi néfastes. Il est suggéré que les réponses aux différents signaux surviennent suite à l'assemblage de ces récepteurs dans des complexes multiprotéiques. Ces derniers sont composés d'ensembles spécifiques de protéines G hétérotrimériques, d'effecteurs et de plusieurs autres partenaires d'interaction, qui modulent la biosynthèse, la signalisation et l'acheminement membranaire du récepteur. Le premier site d'interaction de ces composants s'effectue au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Actuellement, les protéines et les processus de médiation de cet assemblage restent inconnus.Afin d'identifier ces protéines et ces processus de médiation, nous avons développé une nouvelle approche protéomique suivant la purification du beta2AR. Nous avons validé notre approche en détectant plusieurs partenaires d'interaction connus du beta2AR dans des cellules HEK 293, tels que l'adénylate cyclase 3, la protein sensible de fusion de N-ethylmaleimide (NSF), l'ubiquitine, Na+/H+ exchanger regulatory factor 2 (NHERF2) et bien sûr les protéines G hétérotrimériques. De plus, nous avons identifié de nouveaux partenaires d'interaction du beta2AR tels que VCP, gp78 et RNF5, des protéines du système de dégradation associé au RE (ERAD). Nous avons démontré que VCP extrait le beta2AR du RE pour le diriger vers le cytosol afin d'être subséquemment dégradé par le protéasome. L'inhibition du protéasome et la suppression du VCP par l'utilisation de siRNA ont diminué l'interaction du récepteur avec les protéines G et ont augmenté la signalisation du récepteur via la voie ERK1/2. Nous concluons que le beta2AR non complexé aux protéines Gbetagamma est régulé spécifiquement par l'ERAD, ce qui suggère un rôle nouveau pour ERAD dans le contrôle de l'assemblage du complexe de signalisation. Une meilleure compréhension de ce processus pourrait mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisées dans des situations cliniques comme l'insuffisance cardiaque congestive, où la nature de la signalisation du récepteur peut changer dramatiquement.