Breast cancer stroma is a heterogenous mixture of cells types which, in addition to the carcinomatous epithelium itself, consists predominately of endothelium, adipocytes, immune infiltrates and fibroblasts. Recently there has been a movement towards characterizing each of these cells types found within the cancer stroma and understanding how they ultimately impact the disease. The cancer-associated fibroblast (CAF) has garnered a great deal of this attention and numerous in vivo models models have shown the predominance of several pathways CAFs may regulate in order to promote breast cancer progression. Despite the excitement generated by these early investigations into CAFs there has never been an attempt to comprehensively characterize human breast CAFs. It is therefore the hypothesis of thisthesis that the rational design of anti-CAF therapeutics is contingent upon the development of a molecular taxonomy of human breast CAFs. The first objective of this thesis was to aid in the resolution of a longstanding debate within the CAF community pertaining to the nature of DNA-level changes in CAFs. We found that such changes in CAFs are very rare, occurring in only 4% of patients. Interestingly, the very rare changes included a TP53 mutation which conceivably led to widespread chromosomal instability. The second objective was to use microarray technology in order to establishthe above mentioned CAF molecular taxonomy. In our panel of primary human breast CAFs we found that CAFs segregated into one of two groups. The first group tightly clustered with bone marrow-derived mesenchymal stem cells and was composed of CAFs that were almost entirely derived from breast cancers of high histological grade. The second group of CAFs clustered very closely with normal breast fibroblasts and were more often derived from low grade breast cancers. We developed a 186 gene signature that distinguished these two subtypes and showed biological significance inindependent whole breast tumor microarray datasets. Interestingly, the group of patients corresponding to the latter group of CAFs showed a poorer overall survival which we postulated may be due to an epithelial to mesenchymal transition in more aggressive breast carcinomas. The final objective was to develop a functional in vitro co-culture model between a breast cancer cell line and CAFs based on information from the expression profile study. To that end, a group of CAFs were deemed to be positive for a type one interferon (IFN) response and were capable of imparting a pro-cancer effect on the MCF-7 breast cancer cell line in a co-culture model. This effect was largely abolished through assays designed to neutralize the IFN ligand. In addition, the interferon response was correlated to a poorer survival in an independent dataset. We were also able to deduce a putative tumor suppressor gene which could be used as marker of response to future anti-IFN based therapy. Together, these findings have begun to elucidate the inter-patient heterogeneity that exists between CAFs which will greatly aid in the development of future anti-stromal based cancer therapies. / Le stroma de cancer du sein est un mélange hétérogène de types de cellules qui, en plus de l'épithélium carcinomateuse lui-même, se compose essentiellement de l'endothélium, les adipocytes, infiltrats immunitaire et les fibroblastes. Récemment il ya eu un mouvement vers la caractérisation de chacun de ces types de cellules présentes dans le stroma du cancer et de comprendre leur impact sur la maladie. Les fibroblastes associé au cancer (FAC) one reçu beaucoup de cette attention et plusieurs modèles in vivo ont montré la prédominance des FACs en la promotion du cancer du sein. Malgré l'enthousiasme suscité par ces études sur des FACs, il n'a jamais été un effort d'etablir une taxonomie des FACs du sein. Il est donc l'hypothèse de cette thèse que la découverte rationnelle des thérapeutiques contre des FACs est dépendante sur une taxonomie moléculaire des FACs du sein. Le premier objectif de cette thèse était d'aider à la résolution d'un débat dans la communauté CAF concernant des changements d'ADN dans les FACs. Nous avons constaté que de tels changements dans les FACs sont très rares, se produisent dans seulement 4% des patients. Aussi, les changements très rare comprenait une mutation TP53, qui pouvait contribué à l'instabilité chromosomique. Le deuxième objectif était d'utiliser la technologie des biopuces pour d'établir le taxonomie moléculaires des FACs. Dans notre groupe de FACs primaires du sein nous avons observé que les FACs était séparés en deux groups par les expériences avec des biopuces. Le premier groupe était groupé avec des cellules dérivées de la moelle osseuse et était composé de FACs qui étaient presque entièrement dérivées de cancers du sein de haut grade histologique. Le deuxième groupe des FACs avait un profil d'expression très similaire aux fibroblastes mammaires normales et ils étaient dérivées de cancers du sein de bas grade histologique. De plus, nous avons développé une signature de 186 gènes qui distingue ces deux sous-types des FACs et a montré l'importance biologique dans des ensembles biopuce indépendantes de cancer du sein. L'objectif final était de utiliser I'information du biopuces pour développer une modèle in vitro entre une lignée cellulaire de cancer du sein et des FACs. À cette fin, un groupe de FAC ont été jugées positives pour la réponse, de type un, d'interféron (IFN). Cette réponse était capables de conférer un effet 'pro-cancer' sur la lignée cellulaire du cancer du sein MCF-7 dans un modèle de co-culture. Cet effet a été largement aboli grâce à des tests visant à eutraliser le ligand IFN. En plus, la réponse interféron était corrélée à un faible taux de survie dans un ensemble indépendants de biopuce. Nous avons trouvé un gène suppresseur de tumeur putatif qui pourrait être utilisé comme marqueur de la réponse de la thérapie contre l'interféron. Ensemble, ces résultats ont commencé à élucider l'hétérogénéité qui existe entre les FACs des patients de cancer du sein. Éventuellement cela aidera à exploiter le stroma pour l'élaboration des thérapies contre le cancer du sein.

Optical imaging based on fluorescence has yet to be introduced as a clinical diagnostic tool due to the lack of reliable, photostable, and highly luminescent fluorophores. Fluorescent nanocrystals, or quantum dots (QDs), are promising alternatives to organic dyes, since QDs are small in size, resistant to photo-bleaching, and have excellent and appropriate optical properties. The main objective of this work is to use QDs for real-time imaging in live animals. Widespread use of QDs in biology is currently limited due to their questionable biocompatibility, and to the fact that some nanocrystals contain heavy metals, which are potentially hazardous, in their cores. In the present studies the mechanisms underlying the toxicity of cadmium telluride QDs was investigated in several stable cell lines. After long-term exposure to QDs, significant morphological and functional changes were observed at the cellular and subcellular levels. We showed that QD-induced toxicity includes the production of reactive oxygen species, peroxidation of membrane lipids, impairment of mitochondrial function, and changes in the genome and epigenome. Understanding how toxic QDs cause damage to the cells is a first step for i) the establishment of protocols to evaluate the safety of other nanomaterials, and ii) the development of new or improved nanocrystals that are non-toxic. We showed that modifications on QD surfaces with small drug molecules (e.g. N-acetylcysteine) or synthetic polymers can significantly decrease their toxicity, and in some cases, even render the QDs non-toxic. Utilizing a non-invasive route (i.e. intranasal) to deliver nano-probes and nano-therapeutics to the brain, we demonstrated the use of near-infrared fluorescence of non-toxic QDs to image cerebral microlesions in live animals. Repeated imaging in vivo allowed for the live monitoring of lesion size in animals; a reduction of lesion size is a measure of the effectiveness of nano-therapeutic interventions. Animals treated with micelle-incorporated nimodipine or minocycline had significantly smaller lesion volumes, and displayed better recovery of motor function. Quantitative evaluation and volume calculations were possible since the QD signal was isolated from autofluorescence and background after fluorescence lifetime gating. Taken together, the results from this work contribute to the development of QDs and fluorescence technology for biomedical imaging in two main ways: 1) by presenting in vitro measures as the first step in the evaluation of nanomaterial safety. 2) by demonstrating the advantages of using near-infrared QDs for non-invasive lifetime imaging in animals with unilateral cortical ischemic microlesions and for the determination of the spatio-temporal reduction of lesions upon nano-therapeutic interventions. These findings support the use of carefully designed and rigorously tested fluorescent QDs for lifetime optical imaging of the brain in experimental animals, and eventually extending to clinical studies. / L'imagerie par fluorescence reste à introduire dans les cabinets médicaux en raison du manque de fluorophores photo-stables, à haute intensité lumineuse, disponibles sur le marché. Les nanocristaux fluorescents ou boîtes quantiques (BQ), représentent une alternative intéressante par rapport aux teintures organiques car les BQ sont très petits, résistants au photoblanchiment et ont d'excellentes propriétés optiques. L'objectif principal de cette étude est d'utiliser les BQ pour une imagerie en temps réel sur les animaux vivants. L'usage étendu des BQ en biologie est limité en raison de leur biocompatibilité discutable et également en raison du fait que quelques nanocristaux sont composés en partie de métaux lourds. Dans cette étude, les mécanismes cellulaires impliquant la toxicité des BQ de cadmium telluride sont examinés. Après une exposition prolongée aux BQ, des modifications morphologiques et fonctionnelles significatives ont été observées à l'échelle cellulaire et infracellulaire. Nous démontrons que la toxicité induite par les BQ peut entrainer la production d'espèces réactives de l'oxygène, la peroxydation des lipides de la membrane biologique, l'altération du fonctionnement mitochondrial mais aussi des changements du génome et de l'épigénome. Comprendre comment les BQ toxiques endommagent les cellules est un premier pas dans l'établissement de protocoles d'évaluation de la sécurité des nanomatériaux et dans le développement de nouveau nanocristaux non-toxiques. Nous démontrons que la modification de la surface des BQ grâce à des médicaments (ex : N-acetylcysteine) ou des polymères synthétiques peut grandement diminuer leur toxicité, et dans quelques cas, peut aussi rendre les BQ non-toxiques. En utilisant de tel BQ non-toxiques, nous effectuons une démonstration de l'utilisation de la fluorescence infrarouge proche pour effectuer des clichés en temps réel de microlésions cérébrales sur des animaux vivants, à l'aide de méthodes non effractives (ex : voie intra-nasale) pour insérer des nano-sondes ou administrer des nano-thérapies au niveau du cerveau. Des imageries répétées permettent de surveiller la taille des lésions sur les animaux, et prouvent l'efficacité des nano-thérapies dans la prévention de l'expansion de la lésion. Les animaux traités par micelles chargées de nimodipine ou de minocycline ont des lésions moins volumineuses et une meilleure récupération de la fonction motrice. Une évaluation quantitative et un calcul de volume ont été possibles car le signal BQ était séparé de l'autofluorescence tissulaire grâce à de la synchronisation d'image fondé sur la durée de vie fluorescence. L'ensemble des résultats de ces études contribue au développement des BQ et des technologies par fluorescence en imagerie biomédicale, et ceci de deux façons : 1) en présentant des résultats in vitro qui constituent une première étape dans l'évaluation de la sécurité des nanomatériaux. 2) en démontrant des avantages de l'utilisation les BQ infrarouges proches pour l'imagerie non effractives sur les animaux vivants avec des lésions cérébrales et pour la détermination de la réduction des lésions après des nano-thérapies. Ces constatations appuient l'utilisation des BQ fluorescentes créés avec soin et ayant subi des essais précliniques rigoureux pour l'imagerie encéphalique in vivo et s'étendant finalement aux études cliniques.

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest family of cell surface receptors, and thus some of the most important targets for drug discovery. By binding to the orthosteric site where endogenous ligands bind, agonists and antagonists differentially modulate signals sent downstream from these receptors. New evidence suggests that GPCRs possess topographically distinct or allosteric binding sites, which may differentially modulate agonist- and antagonist-mediated responses to selectively affect distinct signalling pathways coupled to the same receptor. These sites may either positively or negatively regulate receptor activity, depending on the pathway in question, and thus can act as biased ligands, leading to functional selectivity (or ligand-directed signalling). Another way of allosterically regulating GPCR signalling is through receptor oligomerization, which has recently emerged as a common mechanism for regulating receptor function. The GPCR for prostaglandin F2α FP, is implicated in many important physiological responses, such as parturition, smooth muscle cell contraction and blood pressure regulation. Therefore, evaluating the potential use of allosteric modulators of FP to fine-tune PGF2α-mediated signals, as well as generating a better understanding of its putative oligomerization partners would be of significant pharmacological and clinical interest. In this thesis, I studied the impact of modulating, in both heterologous (HEK 293 cells) and homologous (osteoblast, myometrial or vascular smooth muscle cells) systems, downstream cellular responses of FP by 1) an orthosteric, but biased ligand, previously characterized as a neutral antagonist 2) an allosteric molecule, designed based on the extracellular domains of FP, which had biased signalling properties and, 3) heterodimerization with a receptor partner, the angiotensin II type I receptor, where I demonstrated the asymmetrical organization of this new signalling unit both in vitro and in vivo. Overall, my thesis unveils important roles for biased, allosteric ligands and receptor oligomerization in modulating FP signalling. This work also demonstrates the importance of understanding distinct receptor conformations, and their effects on cellular responses, which are adopted when GPCRs are allosterically modulated, to design better therapeutics with improved efficacy profiles and reduced side effects. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) repésentent la plus grande famille des récepteurs exprimés à la membrane plasmique et sont aussi considérés comme étant des cibles imporantes dans la découverte de nouveaux médicaments. Lorsque des agonistes ou antagonistes se lient au site de liaison endogène d'un RCPG, ou site orthostérique, ces derniers peuvent en moduler les signaux déployés en aval. De nouvelles évidences suggèrent que les RCPGs possèdent des sites de liaison topographiquement distincts des sites orthostériques, appelés sites allostériques. Ces sites allostériques sont suspectés de sélectivement réguler les différents sentiers de signalisation induits lorsque les récepteurs sont liés, de manière concomitante, par des agonistes ou antagonites. De plus, ces sites allostériques peuvent réguler de manière positive ou négative les différentes activités d'un RCPG, et donc être considérés comme étant des ligands biasés, menant à ce qui est appelé la sélectivité fonctionnelle (aussi connue sous le nom de signalisation dirigée par le ligand). Une autre façon de réguler les signaux des RCPGs, qui est présentement vue comme un autre mécanisme contrôlant leur fonction, est l'oligomérization de ces derniers avec d'autres RCPGs, phénomène pouvant être aussi considéré comme de l'allostérisme. Le RCPG pour la prostaglandine F2α, FP, est impliqué dans plusieur réponses physiologiques d'importance, telles la parturition, la contraction des cellules musculaires lisses, ou même la régulation de la pression sanguine. En somme, l'évaluation des différentes façons par lesquelles les signaux de FP peuvent être altérés, soit par l'utilisation d'un modulateur allostérique, soit par l'oligomérisation avec d'autres RCPG, est considérée primordiale d'un point de vue clinique et pharmacologique.Dans cette thèse, j'ai étudié les impacts de la modulation des réponses en aval de FP dans des systèmes hétérologues (cellules HEK 293) ou homologues (cellules ostéoblastiques, myométriales ou musculaires lisses vasculaires), lorsque celui-ci était régulé par 1) un ligand orthostérique, mais à fonctions biaisées, connu précédemment comme un antagoniste neutre, 2) une molecule allostérique, inspirée des domaines extracellulaires de FP, étant aussi capable de propriétés de signalisation biaisées et par 3) l'hétérodimérisation de FP avec un autre récepteur- « partenaire », le récepteur à l'angiotensine II, pour lequel j'ai démonté la présence d'une organisation asymétrique de cette nouvelle « unité » de signalisation, in vitro et in vivo.De manière générale, ma thèse soulève le rôle des ligands biaisés ou allostériques, ainsi que de l'oligomérisation, dans la modulation des signaux cellulaies dirigés par FP. Le travail accompli démontre aussi l'importance de comprendre les différentes conformations, et leurs effets sur les réponses cellulaires, prises quand les RCPGs sont modulés, afin de générer de meilleurs médicaments ayant une meilleure efficacité, mais aussi des effets secondaires plus minimes.

Hydroxyurea is commonly used to treat myeloproliferative diseases and sickle cell anemia. It is also a potent teratogen, inducing severe developmental malformations in many animal models after in utero exposure. The administration of hydroxyurea to CD1 mice during organogenesis causes predominantly hindlimb, tail, and neural tube defects. Hydroxyurea inactivates ribonucleotide reductase, inhibiting DNA replication and leading to DNA replication stress and cell death. Hydroxyurea exposure during embryo development also induces oxidative stress and p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) signaling. My goal was to test the hypothesis that hydroxyurea-induced p38 MAPK activation, DNA damage, and cell death are spatially related to the malformations observed in organogenesis-stage embryos.Hydroxyurea (400 or 600 mg/kg) or saline was given intraperitoneally to CD1 mice on gestation day 9. Dams were euthanized and whole embryos collected at 0.5, 3 and 6 hours post-treatment. Whole embryo protein extracts were used to examine the protein expression and activation levels of the p38 MAPK pathway using Western blots. Five regions of the embryos, including the rostral and caudal neuroepithelium, neural tube, somites and heart, were selected to determine the localization of proteins and DNA damage, using immunofluorescence and confocal microscopy. Subsequently, quantification of protein expression and DNA damage in the embryo at the subcellular level was determined using 3D imaging software. Hydroxyurea treatment (400 or 600 mg/kg) induced the activation of mitogen-activated protein kinase kinases 3/6 (MEK-3/6), upstream MAP2K3 kinases; phospho-MEK-3/6 immunoreactivity was widespread throughout the embryo after hydroxyurea exposure. Downstream phospho-p38 MAPK was increased in the rostral and caudal neuroepithelium and the neural tube, but not in the somites or heart. Nuclear translocation of phospho-p38 MAPK was significantly elevated in the rostral and caudal regions of embryos 3 hours after hydroxyurea treatment. Hydroxyurea exposure increased DNA damage, as assessed by the formation of γ-H2AX foci, throughout the embryo; the volume of γH2AX foci peaked in the caudal neuroepithelium 3 hours post-treatment with hydroxyurea. Pyknotic nuclei and cell fragmentation increased 3 and 6 hours following hydroxyurea exposure in all regions of the embryo except the heart. These data suggest that the p38 MAPK nuclear signaling and DNA damage response triggered by hydroxyurea exposure play key roles in mediating the caudal malformations that are observed. Further work is needed to evaluate these two stress response pathways in order to elucidate the mechanism of embryonic responses to a teratogenic insult. / L'hydroxyurée est un médicament couramment utilisé pour traiter les maladies myéloprolifératives et l'anémie falciforme. Il a cependant un puissant effet tératogène, causant de graves malformations congénitales chez de nombreux modèles animaux lorsqu'administré durant la grossesse. Le traitement de souris CD1 avec de l'hydroxyurée pendant la période de l'organogenèse provoque principalement des malformations au niveau des membres postérieurs, de la queue et des anomalies du tube neural. L'hydroxyurée inactive la ribonucléotide réductase ce qui diminue la réplication de l'ADN, et mène à la mort cellulaire. Une exposition à l'hydroxyurée au cours du développement embryonnaire induit également un stress oxydatif et active la voie de signalisation p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK p38). Mon objectif était de tester l'hypothèse selon laquelle les malformations observées suite à une exposition à l'hydroxyurée lors de l'organogénèse sont colocalisées avec une activation de MAPK p38, des dommages crées à l'ADN et une mort cellulaire.Au jour 9 de la gestation, des souris CD1 ont été injectées avec de l''hydroxyurée (400 ou 600 mg / kg) ou une solution saline par voie intrapéritonéale. Les mères ont été euthanasiés et les embryons prélevés à 0,5, 3 et 6 heures post-traitement. L'expression de protéines et des niveaux d'activation de la voie de signalisation MAPK p38 ont été quantifiée par par western blot réalisé sur des extraits protéiques entiers de l'embryon. Les protéines et les dommages crées à l'ADN ont été localisés par microscopie confocale et immunofluorescence dans cinq régions de l'embryon comprenant le neuroépithélium rostrale et caudale, le tube neural, les somites et le cœur. Leur localisation au niveau subcellulaire a ensuite été déterminée en utilisant un logiciel d'imagerie 3D.L'hydroxyurée (400 ou 600 mg / kg) induit l'activation des kinases activées par les mitogen-activated protein kinase kinase 3/6 (MEK-3/6) de la catégorie des MAP2K3 kinases; Les embryons provenant des groupes traités à l'hydroxyurée démontrent une immunoréactivité positive de phospho-MEK-3/6 détectée dans les cinq régions analysées de l'embryon. L'expression de phospho-p38 MAPK, la cible cellulaire de MEK-3/6, est élevée dans le neuroépithélium rostrale et caudale et le tube neural, mais pas dans les somites ou les cellules cardiaques. De plus, une translocation nucléaire de phospho-p38 MAPK est significativement induite dans les régions rostrales et caudales des embryons collectés 3 heures après le traitement à l'hydroxyurée. L'exposition à l'hydroxyurée est associée avec une augmentation des dommages crées à l'ADN, telle que démontrée par la formation de foyers de γH2AX dans les cinq régions étudiées de l'embryon. . Le nombre maximal de foyers γH2AX est observé dans le neuroépithélium caudale, 3 heures après l'exposition à l'hydroxyurée. Une augmentation du nombre de noyaux pycnotiques et de cellules avec une ADN fragmentée est détectée 3 à 6 heures après l'exposition à l'hydroxyurée dans toutes les régions de l'embryon à l'exception du cœur. Ces données suggèrent que l'activation de la voie de signalisation MAPK p38 nucléaire et les conséquences des dommages crées à l'ADN provoquées par une exposition à l'hydroxyurée jouent un rôle clé dans l'induction des malformations caudales observées. Des études supplémentaires sont néanmoins nécessaires afin d'investiguer ces deux voies de réponse au stress et ce, dans un but d'élucider les mécanismes de défenses embryonnaire face à un tératogène.

Throughout its maturation, the oocyte will synthesize and store materials that will organize the parental chromatin in the zygote up to the 2 cell stage. The dynamic changes of gene expression in the oocyte throughout folliculogenesis are under the control of a heritable layer of biochemical information called the epigenome which includes covalent modifications to histones and DNA methylation. The setting of the epigenome in the growing oocyte and how deregulation of the oocyte epigenome can affect offspring is not well understood. Lysine specific demethylase 1A (KDM1A) removes mono- and di-methyl groups from histone H3 at lysines 4. In this study I determined the spatial and temporal distribution of Kdm1a in the ovary and found that it is highly expressed in the oocyte. My second objective was to better understand how the oocyte epigenome influences oocyte gene expression and offspring development. To do this we over-expressed KDM1A specifically in the oocyte using transgenic mice. Oocytes from transgenics showed altered expression of 71 genes including those linked to development. Analysis of pregnant transgenics and their offspring revealed increased pre-implantation losses, variable litter sizes and fetuses with skeletal defects. Interestingly, descendants of transgenics that did not carry the transgene themselves also had abnormal reproductive outcomes, suggesting KDM1A targets regions of the oocyte epigenome that escape epigenetic reprogramming. This study show s for the first time that the histone modifier KDM1A is involved in preparing the oocyte for development and can influence developmental outcomes. / Durant les étapes de maturation, l'ovocyte va synthétiser et accumuler les éléments qui permettront l'organisation de la chromatine parentale dans le zygote et ce, jusqu'à l'étape des deux cellules. Les changements de l'expression génique dans l'ovocyte lors de la folliculogenèse sont contrôlés par une information biochimique héréditaire appelée l'épigénôme qui comprend les modifications covalentes des histones et la méthylation de l'ADN. La régulation de l'épigénôme lors de la maturation de l'ovocyte ainsi que les effets d'une perturbation de ce même épigénôme sur le développement de l'embryon après fécondation ne sont pas bien compris. La déméthylase spécifique de la lysine 1A (KDM1A) enlève les groupes mono-et di-méthyle de l'histone H3 au niveau de la lysine 4. Dans cette étude, j'ai déterminé la localisation spatiale et temporelle de Kdm1a dans l'ovaire de souris et j'ai constaté que cette protéine est fortement exprimée dans l'ovocyte. Mon deuxième objectif a consisté en la compréhension plus approfondie des moyens utilisés par l'épigénôme ovocytaire afin d'influencer l'expression génique de l'ovocyte et le développement de l'embryon. Pour ce faire, j'ai surexprimé KDM1A spécifiquement dans l'ovocyte de souris transgéniques. Les ovocytes transgéniques présentait une expression altérée de 71 gènes, dont certains impliqués dans le développement embryonnaire. L'analyse de souris transgéniques gestantes et de leur descendance a révélé une augmentation du nombre de pertes d'embryon préimplantatoires, du nombre de fœtus atteints de malformations notamment au niveau du squelette et, au contraire, une baisse du nombre de nouveau-nés par portée. Il est important de noter que les animaux issus de mère transgénique mais non porteur du transgene eux-mêmes, présentaient également une reproduction altérée, ce qui suggère que les cibles de KDM1A sont des régions de l'épigénôme de l'ovocyte qui échappent à la reprogrammation épigénétique postnatale. Cette étude démontre pour la première fois que KDM1A est impliqué dans la préparation de l'ovocyte afin de permettre le développement embryonnaire et que la modification de son activité peut venir affecter ce développement.

In late gestation, fetal endogenous glucocorticoids increase exponentially. This dramatic increase in glucocorticoids acts to mature several organ systems. As a result, synthetic glucocorticoids (sGCs) are administered to pregnant women at risk of delivering pre-term (>10% of all pregnancies). While this treatment is highly effective in the fetal lung, little is known concerning its long-term consequences in humans. Animal studies have demonstrated that offspring prenatally exposed to sGCs are at risk of behavioral abnormalities and modifications in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and endocrine function; this involves long-term changes in gene expression. Given that the effects of antenatal sGC exposure are stable, long lasting and can manifest across generations, in concert with the fact that early life exposure has the ability to modify the epigenome of offspring, we now hypothesize that epigenetic mechanisms are the route by which sGC permanently modifies behavior and endocrine function in offspring. DNA methylation is a covalent modification of DNA, which plays an essential role in generating stable changes in gene expression. For this reason, the impact of late gestational development and antenatal sGC treatment on global methylation has been investigated. Our results demonstrated organ-specific changes in global methylation, which occur following the endogenous cortisol surge. Further, we noted that these modifications in global methylation could be prematurely initiated by intrauterine exposure to sGC. However, long-term, these sGC-induced global DNA methylation changes are further altered, and these changes are present into adulthood and persist in the next generation. Further, our data indicated that prenatal sGC exposure impacts the expression of several key genes involved in epigenetic regulation.Determining the genome-wide fetal epigenetic landscape was of critical importance to begin to elucidate the mechanisms by which glucocorticoid exposure in late gestation generates its long-term consequences. High-density promoter microarrays identified the fetal hippocampal promoter regions that exhibited differential DNA methylation and Histone-3-lysine-9 (H3K9) acetylation. Our results indicated that the fetal glucocorticoid surge is partially responsible for significantly modifying promoter methylation in a large number of genes. Further, we observed that antenatal sGC exposure significantly impacts DNA methylation and H3K9 acetylation in the fetal hippocampus. The impact of elevated fetal glucocorticoid exposure was further investigated using genome-wide transcription arrays. We noted that exposure to excess glucocorticoids in late gestation substantially altered the mRNA levels of a broad number of genes. Further, we identified fetal hippocampal promoter regulatory regions, in which the glucocorticoid receptor (GR) is bound during late gestational development and following antenatal sGC therapy. Considering the extensive clinical use of antenatal sGC therapy, the data within this thesis are essential, as they provide an understanding of the long-term epigenetic consequences of such a treatment, in a relevant animal model. Further, it advances our knowledge of fetal programming and the underlying mechanisms associated with antenatal sGC treatment. / À la fin de la gestation, les niveaux de glucocorticoïdes endogènes fœtaux augmentent de façon exponentielle. Cette augmentation spectaculaire des glucocorticoïdes agit sur la maturation de nombreux organes. En conséquence, des glucocorticoïdes de synthèse (sGC) sont administrés aux femmes enceintes qui risquent d'accoucher avant terme (>10% des grossesses). Tandis que ce traitement est hautement efficace pour la maturation pulmonaire du fœtus, peu de choses sont connues quant à ses conséquences sur le long terme chez l'homme. Des études chez l'animal ont montré que la progéniture exposée aux sGC pendant la gestation présentait un risque de développer des anomalies de comportement et des modifications dans l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) ainsi que dans les fonctions endocrines; ceci impliquant des changements à long terme de l'expression génique. De plus, Il a été montré que les effets de l'exposition anténatale aux sGC étaient stables, durables et pouvaient se manifester à travers plusieurs générations. Il a récemment été établit que l'exposition au début de la vie avait la capacité de modifier l'épigénome de la descendance. Une unique étude a montré que les sGC pouvaient augmenter l'expression génique dans le foie fœtal par le biais d'une déméthylation de l'ADN des promoteurs. Ainsi, nous avons proposé que des mécanismes épigénétiques pouvaient représenter une voie par laquelle les sGC modifient de façon permanente le comportement et les fonctions endocrines de la progéniture. La méthylation de l'ADN est une modification covalente de l'ADN qui joue un rôle essentiel dans la mise en place de changements stables de l'expression génique. Pour cette raison, l'impact du traitement aux sGC lors du développement gestationnel tardif et anténatal sur les niveaux de méthylation globale a été examiné. Nos résultats montrent des changements dans la méthylation globale spécifiques aux organes, qui se produisent après la poussée de cortisol endogène. De plus, nous avons noté que ces modifications de méthylation globale pouvaient être initiées prématurément par l'exposition intra-utérine aux sGC. Cependant, à long terme, ces changements de méthylation globale, induits par les sGC, sont altérés et ces changements sont présents à l'âge adulte et persistent dans la génération suivante. Par ailleurs, nos données indiquent que l'exposition prénatale aux sGC a un impact sur l'expression de plusieurs gènes clés de la régulation épigénétique. Déterminer le paysage épigénétique à l'échelle du génome entier revêtait une importance capitale pour commencer à élucider les mécanismes par lesquels l'exposition aux glucocorticoïdes en fin de gestation pouvait induire des conséquences à long terme. Des micropuces à haute densité des promoteurs ont permis d'identifier les régions des promoteurs dans l'hippocampe fœtal qui présentaient des différences de méthylation de l'ADN et de l'acétylation de la lysine 9 des histones 3 (H3K9). Nos résultats indiquent que la poussée de glucocorticoïdes fœtaux est partiellement responsable des modifications significatives de la méthylation des promoteurs d'un grand nombre de gènes. De plus, nous avons observé que l'exposition anténatale aux sGC avait un impact significatif sur la méthylation de l'ADN et l'acétylation de H3K9 dans l'hippocampe fœtal. L'impact de l'exposition à des niveaux élevés de glucocorticoïdes fœtaux a été étudié plus avant en utilisant des puces de transcription du génome entier. Nous avons noté que l'exposition à un excès de glucocorticoïdes altérait considérablement les niveaux d'expression génique, et ces changements d'expression sont associés aux niveaux de méthylation de l'ADN de leurs promoteurs. D'autre part, nous avons identifié des régions régulatrices dans les promoteurs dans l'hippocampe fœtal, dans lesquelles GR se lie lors de la gestation tardive et de la thérapie anténatale aux sGC.

Cardiac tamponade hypotension was produced in White Leghorn roosters by infusion of saline into the pericardial sac. Concomitant with the decrease in arterial pressure to 50 mm Hg, the central venous pressure increased 8-fold (up to 12 mm Hg). Despite this marked venous congestion the response to cardiac tamponade was characterized by a significant increase in plasma volume due to the influx of protein-poor interstitial fluid into the vasculature. The mechanisms underlying the hemodilution response in the roosters were markedly different from those involved in the hemodilution response to hypotension in mammals. The observed hemodilution was not mediated by a glucose osmotic gradient and did not appear to involve activation of the sympathoadrenal axis. The increase in central venous pressure was not transmitted to the microvasculature of skeletal muscle. The plasma volume expansion appeared to be due to passive transfer of the fall in arterial pressure to the microcirculation; this indicated a predominant arterial influence on the skeletal muscle microvasculature in the chicken. / Studies on the disruption of normal steady state hemodynamics in the rooster by pressure perturbations imposed by cardiac tamponade suggested that the regulation of normal fluid balance in the chicken was different from that in mammals. Summation of the steady state Starling parameters governing fluid exchange (capillary hydrostatic pressure + tissue oncotic pressure - plasma oncotic presure - tissue hydrostatic pressure) indicated a large imablance in favor of a net fluid filtration from the bloodstream. The maintenance of fluid balance in the chicken appears to involve factors other than those outlined by Starling.

The possible role of endogenous opioids in the central adrenergic control of blood pressure and heart rate was studied in different strains of hypertensive and normotensive rats. In spontaneously hypertensive rats (SHR) the hypotension and bradycardia resulting from stimulation of central (alpha)-adrenoceptors by clonidine or (alpha)-methyldopa are inhibited by the opiate antagonists naloxone and naltrexone and by centrally administered (beta)-endorphin antibody. Clonidine and 1-(alpha)-methylnoradrenaline increase the release of immunoreactive (beta)-endorphin from brain stem slices of SHR, superfused in vitro. The antihypertensive effects of clonidine and (alpha)-methyldopa are similarly inhibited by opiate antagonists in steroid/salt and renal hypertensive, Sprague-Dawley rats, but not in matched normotensive controls for the above three groups of animals. Furthermore, in SHR the centrally mediated acute as well as the chronic antihypertensive action of propranolol is prevented or reversed by naloxone and naltrexone, whereas the hypotensive response to baroreflex activation or to direct electrical stimulation of the nucleus of the solitary tract (NTS) is not inhibited and the bradycardia is potentiated by naltrexone. These findings indicate that the mechanism of action of antihypertensive drugs that act through stimulation (alpha)(,2)-adrenoceptors in the central nervous system involves the release of an endorphin-like opioid from the brainstem and subsequent stimulation of opiate receptors inhibitory to sympathetic tone. The exact central site of this interaction is not known, but in SHR it does not appear to involve the NTS or another component of the baroreflex arc. Finally, the adrenergic-opioid interaction is absent or inactive in normotensive animals, and it appears to be activated by the hypertensive process.

The uptake, metabolism and releasability of ethyl-analogues of homocholine were studied in rat brain and cat superior cervical ganglion. Results from these experiments further describe the specificities of the processes of uptake and acetylation for choline and of storage and release for acetylcholine in the mammalian nervous system. Specificity at the level of the transport mechanism into synaptic vesicles in mammalian brain tissue was identified with acetyldiethylhomocholine, a poor substrate for vesicular compartmentation. This property of the analogue was exploited to study the site of origin of released transmitter from brain slices. When tissue was incubated with ('3)H choline and ('14)C diethylhomocholine, raising the concentration of K('+) caused increased release of ('3)H acetylcholine but not of ('14)C acetylated analogue; during rest, both compounds were released spontaneously. These results suggest that evoked transmitter release originates from the vesicular compartment and spontaneous release from the cytosol. / Diethylhomocholine was also used to investigate the regulation of acetylcholine synthesis in the superior cervical ganglion of the cat. Treatments that affect accumulation and acetylation of choline and releasability of acetylcholine were tested for their effect on the accumulation and acetylation of diethylhomocholine. Results suggest that precursor delivery is important in regulating synthesis but that another factor, probably related to Ca('++) influx during nerve terminal impulse invasion, is also necessary.

In view of calmodulin's widespread role in calcium-regulated processes, together with the requirement of Ca('2+) for chromaffin cell secretion, a possible role for calmodulin in translating the Ca('2+) signal for secretion is suggested. / Isolated bovine adrenal medullary cells were maintained in monolayer culture and their morphological and functional characteristics examined. The cultured chromaffin cell was found capable of accumulating exogenous amines via a high affinity uptake(,1)-like process which closely simulated the neuronal process in many respects but demonstrated neither stereo- nor structural selectivity. The accumulated amines appeared to be uniformly distributed within the chromaffin cell as they were released in parallel with and in equal proportion to the endogenous chromaffin cell catecholamines. This finding proved invaluable in designing a rapid reproducible method for assaying for catecholamine release from the chromaffin cells in culture. / Catecholamine secretion from the chromaffin cells in response to stimulation with either acetylcholine or a depolarizing concentration of K('+) is a Ca('2+)-dependent event. The stimulation-induced amine release was reduced in the presence of trifluoperazine, an antipsychotic agent and potent calmodulin antagonist. However, trifluoperazine blocked catecholamine release from the cultured chromaffin cells at a step distal from Ca('2+) entry, thus providing indirect evidence for a role for calmodulin in the secretory process. More direct evidence for a role for calmodulin in the process of secretion was provided with the use of antibodies raised against calmodulin. In this regard, erythrocyte ghost-mediated microinjection of calmodulin antibodies into viable cell cultures inhibited stimulus-evoked catecholamine secretion from the cultured cells without affecting amine accumulation into these cells. These findings support the hypothesis that calmodulin is important in translating the calcium signal for chromaffin cell secretion. On the other hand, calmodulin appears not to be involved in the catecholamine uptake process in these cells.