Helicobacter pylori yra unikali bakterija. Ji gyvena skrandyje ir dvylikapirštėje žarnoje bei yra viena iš dažniausiai žmogų infekuojančių mikroorganizmų rūšių. H. pylori buvo antras mikroorganizmas, kurio genomo seka buvo pilnai iššifruota ir paskelbta. Tačiau daugelio H.pylori J99 atviro skaitymo rėmelių funkcijų vis dar nėra nustatytos, be to, nėra duomenų apie jų reikšmę bakterijos gyvybingumui. Esminio geno produktas, kuris yra būtinas šios bakterijos išgyvenimui, gali tapti nauju antimikrobiniu taikiniu efektyvių vakcinų gamyboje arba gali būti panaudotas cheminių inhibitorių, kurie iššauktų mikroorganizmo žūtį, kūrime. Galutinis mūsų darbo tikslas yra nustatyti neesminius Helicobacter pylori J99 bakterijos genus, pritaikant naują Biotechnologijos institute Prokariotų genų inžinerijos laboratorijoje sukurtą metodiką, kuri įgalina gana greitai ir pigiai atlikti bakterijų genomų analizę. Magistrinio darbo tikslas buvo - sukonstruoti reprezentatyvų Helicobacter pylori J99 mutantų rinkinį, atlikti jo pirminę analizę ir sukonstruoti mutacijos taškus genome reprezentuojančius DNR žymenis, kuriuos ateityje numatoma panaudoti neesminių H.pylori J99 genų nustatymui. Tikslo pasiekimui buvo sukonstruota reprezentatyvi H.pylori J99 genomo fragmentų klonoteka, kuri perdengė šios bakterijos genomą ~175 kartus. Taip pat buvo sukonstruota speciali DNR kasetė turinti atsparumą chloramfenikolui sąlygojantį geną. Ši kasetė buvo įterpta į gautos H.pylori J99 klonotekos plazmides per... [toliau žr. visą tekstą] / The availability of total genome sequence information from a variety of bacterial genera has facilitated a dramatic increase in loss of function analysis technologies for pathogenic species of clinical relevance. Elucidation of essential metabolic and biosynthetic pathways in pathogenic organisms is critical for identification of new antimicrobial targets. From a pharmaceutical standpoint, it is the ability to rapidly identify essential genes where loss of function is coincident with loss of viability that is driving force behind genomics-based targets validation. The aim of this work was to construct the mutant‘s pool of Helicobacter pylori J99 for identification of nonessential genes and to prepare large amount of DNA tags representing sites for nonessential genes. To achieve this goal we constructed representable H.pylori J99 DNA library which was composed from 240,000 independent clones and overlap H.pylori J99 genome many times. In parallel, special DNA cassette containing chloramphenicol acetyl transferase gene (cat) which confers the chloramphenicol resistance to the H.pylori was constructed and inserted into cloned H.pylori J99 DNA fragments. At least 12,000 different clones containing correct insertions of DNA cassette were selected. Then total plasmid preparation was used for genetic transformation of H.pylori J99 strain. Cells that survived the allelic exchange were selected on agar media containing chloramphenicol. As allelic exchange results DNA cassette... [to full text]