Eukaryotic cells are considered as evolutionary complex organisms because they possess organelles that enable them to regulate the spatio-temporal organization of cellular processes. Spatio-temporal organization of signal transduction cascades occurs in eukaryotic cells via organization of membrane-associated microdomains or lipid rafts. Lipid rafts are nanoscale-sized domains in the plasma membrane that are constituted by a specific set of lipids and proteins and harbor a number of proteins related to signal transduction and trafficking. The integrity of lipid rafts is important for the assembly and functional coordination of a plethora of signaling networks and associated processes. This integrity is partially mediated by a chaperone protein called flotillin. Disruption of lipid raft integrity, for example via depletion or overproduction of flotillin, alters raft-associated signal transduction cascades and causes severe diseases like Alzheimer’s, Parkinson’s disease or cardiovascular disease. It was traditionally assumed that a sophisticated compartmentalization of cellular processes like the one exhibited in lipid rafts was exclusive to eukaryotic cells and therefore, lipid rafts have been considered as a hallmark in the evolution of cellular complexity, suggesting that prokaryotic cells were too simple organisms to organize such sophisticated membrane platforms. However, it was recently discovered that bacteria are also able to organize Functional Membrane Microdomains (FMMs) in their cellular membrane that are able to organize and catalyze the functionality of many diverse cellular processes. These FMMs of bacterial membranes contain flotillin-like proteins which play important roles in the organization of FMM-associated cellular processes. In this dissertation I describe the structural and biological significance of the existence of two distinct flotillin proteins, FloA and FloT, in the FMMs of the bacterial model Bacillus subtilis. Localization studies, proteomic data and transcriptomic analyses show that FloA and FloT are individual scaffold proteins that activate different regulatory programs during bacterial growth. Using the tractable bacterial model system, I show that the functionality of important regulatory proteins, like the protease FtsH or the signaling kinases KinC, PhoR and ResE, is linked to the activity of FMMs and that this is a direct consequence of the scaffold activity of the bacterial flotillins. FloA and FloT distribute heterogeneously along the FMMs of B. subtilis thereby generating a heterogeneous population of FMMs that compartmentalize different signal transduction cascades. Interestingly, diversification of FMMs does not occur randomly, but rather in a controlled spatio-temporal program to ensure the activation of given signaling networks at the right place and time during cell growth. / Eukaryotische Zellen werden als evolutionär komplexe Organismen betrachtet, weil sie Organellen besitzen, mit denen sie die raum-zeitliche Organisation von zellulären Prozessen steuern können. Die räumliche und zeitliche Organisation von Signalwegen in eukaryotischen Zellen erfolgt durch die Abgrenzung von membran-assoziierten Mikrodomänen oder Lipid Rafts. Lipid Rafts sind wenige Nanometer große Felder in der Plasmamembran, die aus einem spezifischen Set von Lipiden und Proteinen zusammengesetzt sind und eine Reihe von für die Signaltransduktion und den Proteintransfer erforderlichen Proteine enthalten. Die Integrität der Lipid Rafts ist wichtig um zahlreiche Signalwege und damit assoziierte Prozesse zu verbinden und funktional zu koordinieren. Diese Integrität wird zum Teil von einem Chaperon-Protein namens Flotillin vermittelt. Eine Beeinträchtigung der Integrität der Lipid Rafts, z.B. aufgrund eines Mangels an Flotillin oder einer Überproduktion von Flotillin, verändert Raft-assoziierte Signalwege und verursacht schwere Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson oder kardiovaskuläre Erkrankungen. Bislang wurde angenommen, dass eine so anspruchsvolle Kompartimentierung zellulärer Prozesse wie im Falle der Lipid Rafts ausschließlich in eukaryotischen Zellen vorkommt. Lipid Rafts galten daher als Meilenstein in der Evolution der zellulären Komplexität und prokaryotische Zellen als zu einfache Organismen, um solch komplexe Plattformen in der Membran einzurichten. Vor kurzem wurde jedoch herausgefunden, dass Bakterien ebenfalls in der Lage sind, Funktionale Mikrodomänen in der Membran (FMMs) zu formen, die viele verschiedene zelluläre Prozesse organisieren und katalysieren können. Diese FMMs in bakteriellen Membranen enthalten Flotillin-ähnliche Proteine, die wichtige Aufgaben bei der Organisation von FMM-assoziierten Prozessen übernehmen. In dieser Dissertation beschreibe ich die strukturelle und biologische Signifikanz des Vorkommens der beiden verschiedenen Flotillin-Proteine FloA und FloT in den FMMs des bakteriellen Modellorganismus Bacillus subtilis. Lokalisationsstudien, proteomische Daten und transkriptomische Analysen demonstrieren, dass FloA und FloT individuelle Gerüstproteine sind, die während des Bakterienwachstums verschiedene regulatorische Programme aktivieren. Mit Hilfe des zugänglichen bakteriellen Modellorganismus zeige ich, dass die Funktionsweise von wichtigen regulatorischen Proteinen, wie z.B. der Protease FtsH oder der Signalwegskinasen KinC, PhoR und ResE, an die Aktivität der FMMs gebunden ist, und dass dies eine direkte Folge der stützenden Tätigkeit der bakteriellen Flotilline ist. FloA und FloT sind unterschiedlich in den FMMs von B. subtilis verteilt, wodurch sie eine heterogene Population von FMMs erzeugen, die verschiedene Signalwege abgrenzen kann. Interessanterweise erfolgt die Diversifizierung der FMMs nicht zufällig, sondern durch ein räumlich und zeitlich kontrolliertes Programm, um die Aktivierung von bestimmten Signalwegen am richtigen Ort und zur richtigen Zeit während des Zellwachstums sicherzustellen.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

München, Techn. Univ., Diss., 2000.

Universiẗat, Diss., 2002--Marburg.

Forschungsgegenstand war ein neuentwickeltes modulares Kassettensystem mit Hedera helix 'Woerner', das im Folgenden als hydroponische Nutzwand bezeichnet wurde. Die Lebensqualität in Ballungsräumen sinkt aufgrund von steigender Verdichtung. Stadtgrün verbessert die Lebensqualität und sorgt für lokale Klima- und Luftverbesserung. Allerdings besteht ein Nutzungskonflikt mit anderen Bebauungsvorhaben. Hier verspricht der Einsatz der hydroponischen Nutzwand ein hohes Potential, da das wandgebundene Fassadenbegrünungssystem weitgehend bodenunabhängig ist. Es erfolgte eine Studie zur Quantifizierung des Leistungspotenzials. Neben einer detaillierten Beschreibung des Kassettensystems und der Versuchsanlage, die eine nach Norden und eine nach Süden exponierte Nutzwand darstellte, erfolgte die Erstellung einer Wasserbilanz und eines abgeleiteten Bewässerungsplanes. Im Substrat wurden Untersuchungen zum Sauerstoffgehalt durchgeführt. Ebenso war auch die Wirkung auf das Bestandsklima ein wesentliches Kriterium, um das Kassettensystem zu beschreiben. Für die Leistungsabschätzung wurden Wachstumsanalysen zur Beschreibung der Pflanzenproduktion durchgeführt. Für einige Kassettenelemente wurde dabei im Wurzelraum ein Pflanzenstärkungsmittel mit Bacillus subtilis angewendet, mit dem Ziel, eine Wachstumssteigerung zu erreichen. In einem Austrocknungsversuch im Gewächshaus wurde der Effekt verschiedener Konzentrationen des Pflanzenstärkungsmittels auf eine erhöhte Stresstoleranz von Hedera helix 'Woerner' untersucht. Der Wasserhaushalt stellte einen gesonderten Schwerpunkt dar, bei dem zwei Ansätze zur Bewässerungssteuerung verfolgt wurden. Es erfolgte eine Modellierung der Evapotranspiration über Daten aus meteorologischen Messungen und Messungen zur Transpiration der Pflanzen im Bestand. In einem zweiten Ansatz wurden die Möglichkeiten der pflanzenbasierten Sensorik untersucht, wofür ein elektronischer Blattdickensensor zum Einsatz kam. Die Erkenntnisse aus der Dissertation sollten zeigen, welche Praxistauglichkeit eine hydroponische Nutzwand besitzt und ob sie lokal in der Lage ist, dem Problem sinkender Lebensqualität im städtischen Raum entgegenzuwirken.

Forschungsgegenstand war ein neuentwickeltes modulares Kassettensystem mit Hedera helix 'Woerner', das im Folgenden als hydroponische Nutzwand bezeichnet wurde. Die Lebensqualität in Ballungsräumen sinkt aufgrund von steigender Verdichtung. Stadtgrün verbessert die Lebensqualität und sorgt für lokale Klima- und Luftverbesserung. Allerdings besteht ein Nutzungskonflikt mit anderen Bebauungsvorhaben. Hier verspricht der Einsatz der hydroponischen Nutzwand ein hohes Potential, da das wandgebundene Fassadenbegrünungssystem weitgehend bodenunabhängig ist. Es erfolgte eine Studie zur Quantifizierung des Leistungspotenzials. Neben einer detaillierten Beschreibung des Kassettensystems und der Versuchsanlage, die eine nach Norden und eine nach Süden exponierte Nutzwand darstellte, erfolgte die Erstellung einer Wasserbilanz und eines abgeleiteten Bewässerungsplanes. Im Substrat wurden Untersuchungen zum Sauerstoffgehalt durchgeführt. Ebenso war auch die Wirkung auf das Bestandsklima ein wesentliches Kriterium, um das Kassettensystem zu beschreiben. Für die Leistungsabschätzung wurden Wachstumsanalysen zur Beschreibung der Pflanzenproduktion durchgeführt. Für einige Kassettenelemente wurde dabei im Wurzelraum ein Pflanzenstärkungsmittel mit Bacillus subtilis angewendet, mit dem Ziel, eine Wachstumssteigerung zu erreichen. In einem Austrocknungsversuch im Gewächshaus wurde der Effekt verschiedener Konzentrationen des Pflanzenstärkungsmittels auf eine erhöhte Stresstoleranz von Hedera helix 'Woerner' untersucht. Der Wasserhaushalt stellte einen gesonderten Schwerpunkt dar, bei dem zwei Ansätze zur Bewässerungssteuerung verfolgt wurden. Es erfolgte eine Modellierung der Evapotranspiration über Daten aus meteorologischen Messungen und Messungen zur Transpiration der Pflanzen im Bestand. In einem zweiten Ansatz wurden die Möglichkeiten der pflanzenbasierten Sensorik untersucht, wofür ein elektronischer Blattdickensensor zum Einsatz kam. Die Erkenntnisse aus der Dissertation sollten zeigen, welche Praxistauglichkeit eine hydroponische Nutzwand besitzt und ob sie lokal in der Lage ist, dem Problem sinkender Lebensqualität im städtischen Raum entgegenzuwirken.:I Inhaltsverzeichnis S. I II Abbildungsverzeichnis S. III III Tabellenverzeichnis S. X IV Formelverzeichnis S. XV V Abkürzungsverzeichnis S. XVII 1 Einleitung S. 1 2 Problemstellung S. 2 3 Zielsetzung S. 9 4 Kassettensystem S. 10 4.1 Material und Methoden S. 21 4.1.1 Versuchsanlage S. 21 4.1.2 Sauerstoffgehalt im Substrat S. 32 4.1.3 Mikroklimatische Einflüsse S. 34 4.2 Ergebnisse S. 43 4.2.1 Versuchsanlage S. 43 4.2.2 Sauerstoffgehalt im Substrat S. 49 4.2.3 Mikroklimatische Einflüsse S. 51 4.3 Diskussion S. 69 4.3.1 Versuchsanlage S. 70 4.3.2 Sauerstoffgehalt im Substrat S. 77 4.3.3 Mikroklimatische Einflüsse S. 78 4.4 Zusammenfassung S. 84 5 Wachstum S. 88 5.1 Material und Methoden S. 92 5.1.1 Wachstumsanalyse S. 92 5.1.2 Trockenstressversuch mit Bacillus subtilis FZB24® flüssig S. 102 5.2 Ergebnisse S. 108 5.2.1 Wachstumsanalysen S. 108 5.2.2 Trockenstressversuch mit Bacillus subtilis FZB24® flüssig S. 120 5.3 Diskussion S. 121 5.3.1 Wachstumsanalysen S. 121 5.3.2 Trockenstressversuch mit Bacillus subtilis FZB24® flüssig S. 125 5.4 Zusammenfassung S. 126 6 Wasserhaushalt S. 128 6.1 Material und Methoden S. 132 6.1.1 Transpiration von Einzelpflanzen S. 132 6.1.2 Evapotranspiration des Pflanzenbestandes S. 134 6.2 Ergebnisse S. 139 6.2.1 Transpiration von Einzelpflanzen S. 139 6.2.2 Evapotranspiration des Pflanzenbestandes S. 143 6.3 Diskussion S. 147 6.3.1 Transpiration von Einzelpflanzen S. 147 6.3.2 Evapotranspiration des Pflanzenbestandes S. 150 6.4 Exkurs Blattdickenmessung S. 151 6.5 Zusammenfassung S. 158 7 Schlussfolgerungen S. 161 8 Anhang Abbildungen S. 165 9 Anhang Tabellen S. 176 10 Literaturverzeichnis S. 191

Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in <br /> pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.<BR><br>Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative <br /> Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.<BR><br>Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10&#176;C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10&#176;C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von <nobr>-&nbsp;64.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.4&nbsp;kJ/mol</nobr> und eine Kooperativität des Übergangs <br /> von <nobr>-&nbsp;58.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.3&nbsp;kJ/(mol&#183;M)</nobr> bestimmt.<BR> <br /> <br>BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden. / Pectate lyases belong to a family of proteins secreted by plant pathogenic microbes. The enzymes cleave alpha-1,4 linked galacturonic acid by a beta-elimination that results in an unsaturated product, which can be quantified spectrophotometrically. Calcium is essential for the activity and the pH-optimum is near 8.5. All known structures of pectate and pectin lyases have the same structural motif - a right handed parallel beta-helix. The structure of pectate lyase from Bacillus subtilis (BsPel) has been solved in complex with calcium. It is a monomeric protein, with a molecular mass of about 43 kDa and without disulfide bonds. This allows its high-yield recombinant expression in the cytoplasm of Escherichia coli. Parallel beta-helices are relative large proteins, however with a simple folding topology. The objective of this work was to characterize the folding mechanism of BsPel. In particular we investigated the role of the interactions of certain residues in the parallel beta-helix for the stability of the native protein and the stability of essential folding intermediates.<br /> <br /> Refolding of BsPel was possible at low protein concentrations and low temperature. However, denaturation of BsPel was not freely reversible. De- and renaturation curves showed a large apparent hysteresis. Furthermore, the folding rate constant deduced from fluorescence and circulardichroism measurements showed a very strong dependence on denaturant concentrations near the midpoint of the renaturation transition. This can be explained with a cooperative unfolding of an essential folding intermediate. Upon stabilisation of the temperature-sensitive intermediate by addition of glycerol in the renaturation buffer, the hysteresis is reduced, but does not disappear. Reverse double mixing kinetic experiments have shown that two transient folding intermediates are on the folding pathway. These intermediates are on parallel pathways and both can fold to the native state. Fluorescence emission spectra have shown the native-like structure of both intermediates. Furthermore, data from proline double mixing kinetic experiments revealed that isomerization of peptidyl-prolyl bonds was responsible for the slow kinetics in the reactivation of the enzyme. However, the isomerization of the single cis-peptidyl-prolyl bond at Pro281 was not responsible for the slowest folding phase observed, but rather the isomerization of other trans-peptidyl-prolyl bonds. Thus, both transient folding intermediates observed probably represent two populations of folding intermediates with non-native X-Pro-peptide bonds. The difference of the two populations is at least one non-native X-Pro-peptide bond.<br /> <br /> Mutations of the proline 281 against various residues (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) resulted in a strong destabilization of the native protein. Also, the activity of the mutant proteins was strong reduced due to the position of the mutation site near the putative active center of the protein. At 10&#176;C the kinetic folding behavior of the proline mutants was not significant changed. However, the strong destabilization of the native state in the proline mutants resulted in a reversible folding equilibrium at pH 7 and 10&#176;C. The unfolding of the P281A mutant was reversible as determined by fluorescence emission and enzyme activity measurements. The coincidence of these detected transitions is consistent with a two-state equilibrium transition. At pH 7 and 10&#176;C the delta G&#176;(H₂O) for folding of P281A was <nobr>-&nbsp;64.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.4&nbsp;kJ/mol,</nobr> with a midpoint of the transition at 1.1 M GdmCl and a cooperativity of <nobr>-&nbsp;58.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.3&nbsp;kJ/(mol&#183;M).</nobr><br /> <br /> BsPel has an asparagine ladder in turn 2 of the parallel beta-helix with extensive network of side-chain hydrogen bonds between the Asn residues. Such an Asn-ladder is a conserved feature of many monomeric beta-helices crystallized so far. The middle Asn residue (271) was selected and exchanged for various residues. Most of the mutants were expressed at 25&#176;C as soluble and active proteins but with a significant reduction in yield. Mutants N271T and N271A were selected to study the stability and refolding of these proteins in comparison with the wild-type protein. The substitution in the Asn-ladder did not drastically destabilize the native protein, but caused a temperature-sensitive-folding (tsf) phenotype with an increased hysteresis in the de- and renaturation transition curves. In addition, the disruption of the Asn-ladder resulted in destabilization of an essential, thermosensitive folding intermediate. Thus, the Asn-ladder is formed very early during the folding, probably well before the transition state of folding.