Made available in DSpace on 2016-05-16T12:51:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 guilherme_oliveira_ipec_mest_2013.pdf: 367173 bytes, checksum: 5d7981c2440bb9c06602493f281a31ae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana (LTA), em cães, costuma estar associada à resposta humoral baixa ou mesmo negativa, o que inviabiliza os métodos sorológicos convencionais, como ferramenta única no diagnóstico. A busca por métodos mais sensíveis no diagnóstico tem avançado muito com o emprego de métodos moleculares, e a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) tem fornecido inúmeros resultados fundamentais nos estudos epidemiológicos. Métodos convencionais de diagnóstico parasitológico, não têm sido capazes de detectar a presença do parasito em outros sítios anatômicos diferentes da lesão cutânea, em cães naturalmente infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis. Diante dos questionamentos sobre o papel do cão doméstico no ciclo de transmissão da LTA e sobre o valor de métodos diagnósticos aplicados na rotina, principalmente em áreas de sobreposição da forma tegumentar e visceral, faz-se necessário a avaliação desses animais sob diversos aspectos. O presente estudo teve como objetivo empregar a PCR específica associada à hibridização molecular e a técnica da reação em cadeia da polimerase com primer único em condições de baixa estringência (LSSP-PCR) visando detectar a presença de DNA parasitário e investigar a variabilidade genética de populações parasitárias presentes em diferentes tecidos de cães naturalmente infectados por L. (V.) braziliensis. Os animais foram selecionados entre os cães sororeatores para Leishmania procedentes de cidades do estado do Rio de Janeiro e encaminhados para eutanásia ao Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz. Durante a necropsia, foram obtidas amostras de lesão cutânea, pele íntegra (região escapular e abdominal), baço, fígado e linfonodos (poplíteo e cervical) Os fragmentos teciduais foram submetidos ao isolamento parasitário e à extração de DNA. A detecção de DNA de L. (V.) braziliensis foi realizada através da amplificação, pela PCR específica, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam a região variável dos minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA) de espécies do subgênero Viannia. Os produtos positivos na PCR foram reamplificados, pela técnica de LSSP-PCR, utilizando-se um único iniciador do par específico, em condições de baixa temperatura de anelamento. O polimorfismo genético da região variável dos minicírculos foi avaliado através de métodos de análise numérica. Nove animais foram estudados. O isolamento parasitário foi possível somente nos fragmentos de lesão cultivados em todos os animais, no entanto com a aplicação das técnicas moleculares mencionadas, foi possível detectar DNA de L. (V.) braziliensis em pele íntegra de cães naturalmente infectados tendo sido, ao nosso conhecimento, o primeiro relato no Brasil. Foi também possível observar o tropismo diferenciado e a capacidade de disseminação parasitária para outros sítios anatômicos, além da lesão cutânea, no cão naturalmente infectado. Nossos resultados contribuirão para o diagnóstico e a epidemiologia da LTA canina no Rio de Janeiro fornecendo elementos na discussão da importância do papel do cão no ciclo de transmissão e subsídios para os programas de controle / In dogs, A merican tegumentary leishmaniasis (ATL) is usually associated to a low humoral response or even to negative results which turns not unfeasible the conventional serological methods. The search for more sensitive methods in the diagno sis has progressed by the use of molecular methods and, the technique of polymerase chain reaction (PCR) has been furnishing several results which can be consider of fundamental importance in epidemiological studies. Conventional methods of parasitologic al diagnosis have failed to detect the presence of the parasite anatomic sites others than the cutaneous lesion, in dogs naturally infected by Leishmania (Viannia) braziliensis. Regarding the questions on the rule of domestic dogs in the transmission cycle of ATL and, on the applicability of diagnostic methods mainly in areas where both visceral and tegumentary disease are found, the evaluation of these animals under different aspects is needed. The objective of this project is to apply specific PCR assays associated to molecular hybridization and the technique of Low - Stringency Specific - Single Primer – PCR (LSSP - PCR) in order to detect the presence of parasite DNA and evaluate the gen etic variability of parasite populations found in different tissues of dog s naturally infected by Leishmania (V.) braziliensis . The animals were selected among dogs which were Leishmania seropositive from cities of Rio de Janeiro state and referred for euthanasia to the Derm o zoo laboratory ( Laboratório de Pesquisa Clínica em Der matozoonoses em Animais Domésticos do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas da Fundação Oswaldo Cruz ) . Samples were obtained from cutaneous lesions, health skin, spleen, liver and lymph nodes (popliteal and cervical). Tissue fragments were submitted to parasite isolation and to DNA extractions. The detection of L. (V.) braziliensis was performed by specific PCR assays, using a par of primers that amplify the variable region of the minicircles of the kinetoplast DNA (kDNA) from species of the Viannia subgenus. The positive PCR products were re - amplified by the technique of LSSP - PCR using a unique primer of the specific par, in low stringency conditions. The genetic polymorphism of the variable region of kDNA minicircles were investigated through numeri cal analysis methods. Nine animals were studied. The parasitic isolation was only possible in fragments cultured in lesion of all animals. U sing such methods, it was possible to detect L. (V.) braziliensis DNA in heath skin of dogs naturally infected. To o ur knowledge this is the first report in Brazil. It was also possible to observe the differentiate tropism and the capacity of parasite dissemination to other anatomic sites beyond the cutaneous lesion. Our results will contribute, at the same time, to the diagnosis and the epidemiology of canine ATL in Rio de Janeiro, providing basis for the discussion of the rule of the dog in the transmission cycle of ATL and, also providing subsidies to the control programs.