O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, causador da hidatidose cística. Durante o ciclo de vida no hospedeiro intermediário (ovinos ou bovinos e, acidentalmente, o homem) há a formação de um cisto hidático, que abriga a forma pré-adulta do parasito, o protoescólex (PSC), que, ao ser ingerida pelo hospedeiro definitivo (geralmente o cão doméstico), desenvolver-se-á no verme adulto. De outra forma, o cisto primário fértil pode romper-se e extravazar seu conteúdo no interior do hospedeiro intermediário, o que induz os PSCs à formação de cistos hidáticos secundários. Embora existam vários relatos na literatura acerca da utilização de proteínas como biomarcadores para fases de desenvolvimento em outras espécies, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos nessa plasticidade do parasito. Uma opção de estudo está na resposta do parasito a um evento indutor, sendo interessante a marcação de proteínas recém-sintetizadas (PRS), realizada com aminoácidos radioativos ou, mais recentemente, com a utilização de aminoácidos artificiais. Dessa forma, o presente estudo visa melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, através da análise de PRS nos PSCs com a incorporação do aminoácido artificial azido-homoalanina (AHA). Para isso, estudamos diferentes condições para a diferenciação estrobilar de PSCs in vitro e a incorporação de AHA, utilizando um tratamento inicial com pepsina seguido por cultivo em meio bifásico contendo taurocolato. Dessa forma, foi possível visualizar alterações morfológicas características da estrobilização já descritas na literatura, como a diminuição no número de corpúsculos calcários e a formação do canal excretor e bexiga. Após 72 h de incubação dos PSCs em meio bifásico suplementado com AHA, as PRS foram extraídas e marcadas com tetrametilrodamina. A eficiência da incorporação da AHA foi confirmada por SDS-PAGE 12% e visualização com luz ultravioleta, resultando num padrão de bandas complexo, com proteínas de 10 a 225 kDa, sendo este o primeiro relato de marcação e detecção de PRS com AHA em platelmintos. / The Echinococcus granulosus is a parasite of Class Cestoda, which causes cystic hydatid disease. During its life cycle in the intermediate host (sheep or cattle and accidentally man), initiates the formation of a hydatid cyst, which contains the pre-adult form of the parasite, the protoescolex (PSC). When ingested by a definitive host (usually the domestic dog), the PSC will develop into the adult worm. Another possibility is the rupture of the primary fertile cyst, releasing PSCs in the intermediate host, which may develop into secondary hydatid cysts. Although there are several reports in the literature about the use of proteins as biomarkers for developmental stages, little is known about the mechanisms involved in the plasticity of E. granulosus. A possible way to study this process is to analyze the parasite response to an inducing event, by labeling newly synthesized proteins (NSP), using radioactive amino acids or, more recently, artificial amino acids. This study aims to better understand the molecular mechanisms involved in the estrobilar development of E. granulosus by analyzing NSP in PSCs with the incorporation of the artificial amino acid azidohomoalanine (AHA). For this purpose, we have used different methods for cultivation that led to the in vitro PSCs’ estrobilar differentiation with an initial pepsin treatment, followed by cultivation in biphasic medium containing taurocholate. Using this procedure, it was possible to observe the morphological changes characteristic of the strobilation stages already described in the literature, such as the decrease in the number of calcareous corpuscles or the visualization of the excretory canal and the bladder. Following incubation of PSCs in biphasic medium supplemented with AHA, the NSP were extracted and labeled with tetramethylrhodamine. The incorporation efficiency of AHA was confirmed by analysis on 12% SDS-PAGE and exposure to UV light, showing a complex pattern of bands, with proteins between 10-225 kDa. This is the first report of labeling and detection of NSP with AHA in flatworms.

A expressão “proteínas moonlighting” refere-se a um subgrupo de proteínas multifuncionais, onde duas ou mais funções são realizadas por uma mesma cadeia polipeptídica. Dentre as proteínas com funções moonlighting estão diversas enzimas glicolíticas que podem desempenhar papeis importantes em processos-chave na biologia de organismos parasitas, como os de motilidade, adesão, invasão e diferenciação. A aldolase, a enolase e a lactato-desidrogenase (LDH) estão entre as enzimas que foram detectadas nos produtos de excreção-secreção (ES) e em tecidos de interface com o hospedeiro de Echinococcus granulosus, o cestódeo causador da hidatidose cística em seres humanos e ungulados domésticos. Neste contexto, a caracterização destas enzimas pode revelar possíveis funções moonligthing por elas desempenhadas e contribuir para a compreensão de aspectos básicos do desenvolvimento do parasito e de possíveis mecanismos de interação com os hospedeiros. Inicialmente, as sequências codificadoras da aldolase (EgAldo), da enolase (EgEno) e da LDH (EgLDH) de E. granulosus foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em um vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli, para a produção das proteínas recombinantes correspondentes (rEgAldo, rEgEno e rEgLDH, respectivamente). Soros de pacientes humanos com hidatidose reconhecem, em imunoblots, a EgAldo e EgEno nativas mas não reconhecem as proteínas recombinantes correspondentes, sugerindo o envolvimento de epitopos não proteicos no reconhecimento desses antígenos. Antissoros policlonais contra a rEgAldo e a rEgEno evidenciaram, em protoescólices, uma localização predominantemente citoplasmática para as proteínas nativas cognatas. Elas também foram detectadas na camada germinativa e no líquido hidático, que representam interfaces entre o parasito e o hospedeiro. Além disso, tanto a EgAldo como a EgEno foram reconhecidas em frações de proteínas tegumentares e em produtos de ES de protoescólices, localizações sugestivas de funções moonlighting. Proteínas do parasito e do hospedeiro intermediário que interagem com as proteínas rEgAldo, rEgEno e rEgLDH foram recuperadas por experimentos de GST pull-down para posterior identificação destas proteínas por espectrometria de massas. A identificação destas proteínas de interação poderá apontar processos não-glicolíticos nos quais estas enzimas estejam envolvidas. / The term “moonlighting proteins” refers to a subset of multifunctional proteins in which two or more different functions are performed by one polipeptide chain. Among the proteins described as moonlighting, there are many glycolytic enzymes that play important roles in key processes in the biology of parasites, such as motility, adhesion, invasion and cell differentiation. Aldolase, enolase and lactate dehydrogenase are among the enzymes that have been detected in the excretory-secretory (ES) products and in the host-interacting metacestode components from Echinococcus granulosus, a cestode that causes cystic hydatid disease and affects both humans and livestock. In this context, the characterization of these enzymes may reveal possible moonlighting functions they perform and contribute to the understanding of basic aspects of the parasite development and differentiation and possible interaction mechanisms with the intermediate host. Initially, the complete coding sequences from E. granulosus aldolase (EgAldo), enolase (EgEno) and lactate dehydrogenase (EgLDH) were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production (rEgAldo, rEgEno and rEgLDH, respectively). Sera from human hydatid disease patients recognize in immunoblots the native EgAldo and EgEno, but not its recombinant counterparts, which was taken as evidence of involvement of non proteic epitopes in the EgAldo and EgEno recognition. Polyclonal antiserum against rEgAldo and rEgEno have shown, in protoscoleces, a predominantly cytoplasmic localization for the cognate native proteins, as expected for glycolytic enzymes. They have also been detected in the germinal layer and hydatid fluid, which represent host-parasite interfaces. Furthermore, both EgAldo and EgEno were recognized in protoscoleces tegument extracts and in ES products from these parasites in culture, which are indicative of moonlighting functions. Parasite and intermediate host proteins that interact with proteins rEgAldo, rEgEno and rEgLDH in vitro were recovered by GST pull-down assays and the identification of these proteins will be performed using mass spectrometry. Identification of interacting proteins may also be an indication that these enzymes perform nonglycolytic functions.

A hidatidose cística é uma zoonose helmíntica endêmica causada pela infecção com a forma larval ou metacestódeo de Echinococcus granulosus. Neste trabalho, foi realizada uma análise proteômica do metacestódeo de E. granulosus durante a infecção do seu hospedeiro intermediário bovino. A identificação de proteínas do parasito e do hospedeiro presentes nos diferentes componentes da larva do parasito (protoescólices, camada germinativa e líquido hidático) gerou informações valiosas sobre a relação parasitohospedeiro. Os resultados obtidos permitiram a caracterização da resposta imune montada pelo hospedeiro contra a infecção por E. granulosus, bem como de potenciais estratégias moleculares adotadas pelo parasito para evadir essa resposta e promover a sua sobrevivência dentro do corpo do hospedeiro. Além disso, novas proteínas-alvo foram identificadas para o desenvolvimento ou melhora de ferramentas de diagnóstico, tratamento e controle da hidatidose. Nesse trabalho, foi também estudada a estrutura do antígeno B (AgB) de E. granulosus, uma proteína implicada em múltiplas interações parasito-hospedeiro durante a infecção. Medidas de espalhamento de luz dinâmico utilizando subunidades recombinantes (AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3) demonstraram que o AgB forma diferentes estruturas moleculares sob condições fisiológicas, incluindo oligômeros e agregados de alta massa molecular. As subunidades recombinantes do AgB mostraram diferentes tendências agregativas, sendo os agregados de alta massa molecular formados por AgB8/3 os mais similares, em morfologia e tamanho, àqueles do AgB produzido pelo parasito. Experimentos de dissociação induzida por pressão revelaram que a formação de pontes dissulfeto confere maior estabilidade aos homo-oligômeros de AgB8/2 e AgB8/3. A composição de subunidades do AgB foi avaliada por espectrometria de massas (MS), identificando as subunidades AgB8/1, AgB8/3 e AgB8/4, o que indica uma contribuição principal dessas subunidades nas propriedades estruturais, biológicas e imunológicas do AgB de E. granulosus. A análise de MS indicou também uma associação entre AgB e Ag5, os principais antígenos secretados pelo metacestódeo de E. granulosus. / Cystic hydatid disease (CHD) is an endemic helminthic zoonosis caused by infection with the larval stage or metacestode of the tapeworm Echinococcus granulosus. Here, we performed a proteomic analysis of the E. granulosus metacestode during infection of its intermediate bovine host. Identification of parasite and host proteins present in different components of parasite larvae (protoscoleces, germinal layer and hydatid cyst fluid) provided valuable information on host-parasite interplay. Our results allowed the characterization of host immune response mounted against E. granulosus infection, as well as potential molecular strategies adopted by the parasite to avoid this response and promote its survival inside the host body. Moreover, new protein targets were identified for the development or improvement of CHD diagnosis, treatment, and control tools. In this work, we also study the structure of E. granulosus antigen B (AgB), a protein implicated in multiple host-parasite interactions during infection. Dynamic light scattering experiments with recombinant subunits (AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3) demonstrated that AgB form different molecular assemblies under physiological conditions, including oligomers and high-molecular-weight aggregates. AgB recombinant subunits showed different aggregative tendencies, being AgB8/3 high-molecular-weight aggregates most similar, both in morphology and size, to those of parasite-produced AgB. Pressure-induced dissociation experiments revealed that disulfide bonds formation confers greater stability to AgB8/2 and AgB8/3 homo-oligomers. AgB subunit composition was evaluated by mass spectrometry (MS), identifying AgB8/1, AgB8/3 and AgB8/4 subunits, which indicates a major contribution for these subunits on E. granulosus AgB structural, biological, and immunological properties. The MS analysis also indicated an association between AgB and Ag5, the major antigens secreted by E. granulosus metacestode.

A expressão “proteínas moonlighting” refere-se a um subgrupo de proteínas multifuncionais, onde duas ou mais funções são realizadas por uma mesma cadeia polipeptídica. Dentre as proteínas com funções moonlighting estão diversas enzimas glicolíticas que podem desempenhar papeis importantes em processos-chave na biologia de organismos parasitas, como os de motilidade, adesão, invasão e diferenciação. A aldolase, a enolase e a lactato-desidrogenase (LDH) estão entre as enzimas que foram detectadas nos produtos de excreção-secreção (ES) e em tecidos de interface com o hospedeiro de Echinococcus granulosus, o cestódeo causador da hidatidose cística em seres humanos e ungulados domésticos. Neste contexto, a caracterização destas enzimas pode revelar possíveis funções moonligthing por elas desempenhadas e contribuir para a compreensão de aspectos básicos do desenvolvimento do parasito e de possíveis mecanismos de interação com os hospedeiros. Inicialmente, as sequências codificadoras da aldolase (EgAldo), da enolase (EgEno) e da LDH (EgLDH) de E. granulosus foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em um vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli, para a produção das proteínas recombinantes correspondentes (rEgAldo, rEgEno e rEgLDH, respectivamente). Soros de pacientes humanos com hidatidose reconhecem, em imunoblots, a EgAldo e EgEno nativas mas não reconhecem as proteínas recombinantes correspondentes, sugerindo o envolvimento de epitopos não proteicos no reconhecimento desses antígenos. Antissoros policlonais contra a rEgAldo e a rEgEno evidenciaram, em protoescólices, uma localização predominantemente citoplasmática para as proteínas nativas cognatas. Elas também foram detectadas na camada germinativa e no líquido hidático, que representam interfaces entre o parasito e o hospedeiro. Além disso, tanto a EgAldo como a EgEno foram reconhecidas em frações de proteínas tegumentares e em produtos de ES de protoescólices, localizações sugestivas de funções moonlighting. Proteínas do parasito e do hospedeiro intermediário que interagem com as proteínas rEgAldo, rEgEno e rEgLDH foram recuperadas por experimentos de GST pull-down para posterior identificação destas proteínas por espectrometria de massas. A identificação destas proteínas de interação poderá apontar processos não-glicolíticos nos quais estas enzimas estejam envolvidas. / The term “moonlighting proteins” refers to a subset of multifunctional proteins in which two or more different functions are performed by one polipeptide chain. Among the proteins described as moonlighting, there are many glycolytic enzymes that play important roles in key processes in the biology of parasites, such as motility, adhesion, invasion and cell differentiation. Aldolase, enolase and lactate dehydrogenase are among the enzymes that have been detected in the excretory-secretory (ES) products and in the host-interacting metacestode components from Echinococcus granulosus, a cestode that causes cystic hydatid disease and affects both humans and livestock. In this context, the characterization of these enzymes may reveal possible moonlighting functions they perform and contribute to the understanding of basic aspects of the parasite development and differentiation and possible interaction mechanisms with the intermediate host. Initially, the complete coding sequences from E. granulosus aldolase (EgAldo), enolase (EgEno) and lactate dehydrogenase (EgLDH) were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production (rEgAldo, rEgEno and rEgLDH, respectively). Sera from human hydatid disease patients recognize in immunoblots the native EgAldo and EgEno, but not its recombinant counterparts, which was taken as evidence of involvement of non proteic epitopes in the EgAldo and EgEno recognition. Polyclonal antiserum against rEgAldo and rEgEno have shown, in protoscoleces, a predominantly cytoplasmic localization for the cognate native proteins, as expected for glycolytic enzymes. They have also been detected in the germinal layer and hydatid fluid, which represent host-parasite interfaces. Furthermore, both EgAldo and EgEno were recognized in protoscoleces tegument extracts and in ES products from these parasites in culture, which are indicative of moonlighting functions. Parasite and intermediate host proteins that interact with proteins rEgAldo, rEgEno and rEgLDH in vitro were recovered by GST pull-down assays and the identification of these proteins will be performed using mass spectrometry. Identification of interacting proteins may also be an indication that these enzymes perform nonglycolytic functions.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, causador da hidatidose cística. Durante o ciclo de vida no hospedeiro intermediário (ovinos ou bovinos e, acidentalmente, o homem) há a formação de um cisto hidático, que abriga a forma pré-adulta do parasito, o protoescólex (PSC), que, ao ser ingerida pelo hospedeiro definitivo (geralmente o cão doméstico), desenvolver-se-á no verme adulto. De outra forma, o cisto primário fértil pode romper-se e extravazar seu conteúdo no interior do hospedeiro intermediário, o que induz os PSCs à formação de cistos hidáticos secundários. Embora existam vários relatos na literatura acerca da utilização de proteínas como biomarcadores para fases de desenvolvimento em outras espécies, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos nessa plasticidade do parasito. Uma opção de estudo está na resposta do parasito a um evento indutor, sendo interessante a marcação de proteínas recém-sintetizadas (PRS), realizada com aminoácidos radioativos ou, mais recentemente, com a utilização de aminoácidos artificiais. Dessa forma, o presente estudo visa melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, através da análise de PRS nos PSCs com a incorporação do aminoácido artificial azido-homoalanina (AHA). Para isso, estudamos diferentes condições para a diferenciação estrobilar de PSCs in vitro e a incorporação de AHA, utilizando um tratamento inicial com pepsina seguido por cultivo em meio bifásico contendo taurocolato. Dessa forma, foi possível visualizar alterações morfológicas características da estrobilização já descritas na literatura, como a diminuição no número de corpúsculos calcários e a formação do canal excretor e bexiga. Após 72 h de incubação dos PSCs em meio bifásico suplementado com AHA, as PRS foram extraídas e marcadas com tetrametilrodamina. A eficiência da incorporação da AHA foi confirmada por SDS-PAGE 12% e visualização com luz ultravioleta, resultando num padrão de bandas complexo, com proteínas de 10 a 225 kDa, sendo este o primeiro relato de marcação e detecção de PRS com AHA em platelmintos. / The Echinococcus granulosus is a parasite of Class Cestoda, which causes cystic hydatid disease. During its life cycle in the intermediate host (sheep or cattle and accidentally man), initiates the formation of a hydatid cyst, which contains the pre-adult form of the parasite, the protoescolex (PSC). When ingested by a definitive host (usually the domestic dog), the PSC will develop into the adult worm. Another possibility is the rupture of the primary fertile cyst, releasing PSCs in the intermediate host, which may develop into secondary hydatid cysts. Although there are several reports in the literature about the use of proteins as biomarkers for developmental stages, little is known about the mechanisms involved in the plasticity of E. granulosus. A possible way to study this process is to analyze the parasite response to an inducing event, by labeling newly synthesized proteins (NSP), using radioactive amino acids or, more recently, artificial amino acids. This study aims to better understand the molecular mechanisms involved in the estrobilar development of E. granulosus by analyzing NSP in PSCs with the incorporation of the artificial amino acid azidohomoalanine (AHA). For this purpose, we have used different methods for cultivation that led to the in vitro PSCs’ estrobilar differentiation with an initial pepsin treatment, followed by cultivation in biphasic medium containing taurocholate. Using this procedure, it was possible to observe the morphological changes characteristic of the strobilation stages already described in the literature, such as the decrease in the number of calcareous corpuscles or the visualization of the excretory canal and the bladder. Following incubation of PSCs in biphasic medium supplemented with AHA, the NSP were extracted and labeled with tetramethylrhodamine. The incorporation efficiency of AHA was confirmed by analysis on 12% SDS-PAGE and exposure to UV light, showing a complex pattern of bands, with proteins between 10-225 kDa. This is the first report of labeling and detection of NSP with AHA in flatworms.

A hidatidose cística é uma zoonose helmíntica endêmica causada pela infecção com a forma larval ou metacestódeo de Echinococcus granulosus. Neste trabalho, foi realizada uma análise proteômica do metacestódeo de E. granulosus durante a infecção do seu hospedeiro intermediário bovino. A identificação de proteínas do parasito e do hospedeiro presentes nos diferentes componentes da larva do parasito (protoescólices, camada germinativa e líquido hidático) gerou informações valiosas sobre a relação parasitohospedeiro. Os resultados obtidos permitiram a caracterização da resposta imune montada pelo hospedeiro contra a infecção por E. granulosus, bem como de potenciais estratégias moleculares adotadas pelo parasito para evadir essa resposta e promover a sua sobrevivência dentro do corpo do hospedeiro. Além disso, novas proteínas-alvo foram identificadas para o desenvolvimento ou melhora de ferramentas de diagnóstico, tratamento e controle da hidatidose. Nesse trabalho, foi também estudada a estrutura do antígeno B (AgB) de E. granulosus, uma proteína implicada em múltiplas interações parasito-hospedeiro durante a infecção. Medidas de espalhamento de luz dinâmico utilizando subunidades recombinantes (AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3) demonstraram que o AgB forma diferentes estruturas moleculares sob condições fisiológicas, incluindo oligômeros e agregados de alta massa molecular. As subunidades recombinantes do AgB mostraram diferentes tendências agregativas, sendo os agregados de alta massa molecular formados por AgB8/3 os mais similares, em morfologia e tamanho, àqueles do AgB produzido pelo parasito. Experimentos de dissociação induzida por pressão revelaram que a formação de pontes dissulfeto confere maior estabilidade aos homo-oligômeros de AgB8/2 e AgB8/3. A composição de subunidades do AgB foi avaliada por espectrometria de massas (MS), identificando as subunidades AgB8/1, AgB8/3 e AgB8/4, o que indica uma contribuição principal dessas subunidades nas propriedades estruturais, biológicas e imunológicas do AgB de E. granulosus. A análise de MS indicou também uma associação entre AgB e Ag5, os principais antígenos secretados pelo metacestódeo de E. granulosus. / Cystic hydatid disease (CHD) is an endemic helminthic zoonosis caused by infection with the larval stage or metacestode of the tapeworm Echinococcus granulosus. Here, we performed a proteomic analysis of the E. granulosus metacestode during infection of its intermediate bovine host. Identification of parasite and host proteins present in different components of parasite larvae (protoscoleces, germinal layer and hydatid cyst fluid) provided valuable information on host-parasite interplay. Our results allowed the characterization of host immune response mounted against E. granulosus infection, as well as potential molecular strategies adopted by the parasite to avoid this response and promote its survival inside the host body. Moreover, new protein targets were identified for the development or improvement of CHD diagnosis, treatment, and control tools. In this work, we also study the structure of E. granulosus antigen B (AgB), a protein implicated in multiple host-parasite interactions during infection. Dynamic light scattering experiments with recombinant subunits (AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3) demonstrated that AgB form different molecular assemblies under physiological conditions, including oligomers and high-molecular-weight aggregates. AgB recombinant subunits showed different aggregative tendencies, being AgB8/3 high-molecular-weight aggregates most similar, both in morphology and size, to those of parasite-produced AgB. Pressure-induced dissociation experiments revealed that disulfide bonds formation confers greater stability to AgB8/2 and AgB8/3 homo-oligomers. AgB subunit composition was evaluated by mass spectrometry (MS), identifying AgB8/1, AgB8/3 and AgB8/4 subunits, which indicates a major contribution for these subunits on E. granulosus AgB structural, biological, and immunological properties. The MS analysis also indicated an association between AgB and Ag5, the major antigens secreted by E. granulosus metacestode.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, causador da hidatidose cística. Durante o ciclo de vida no hospedeiro intermediário (ovinos ou bovinos e, acidentalmente, o homem) há a formação de um cisto hidático, que abriga a forma pré-adulta do parasito, o protoescólex (PSC), que, ao ser ingerida pelo hospedeiro definitivo (geralmente o cão doméstico), desenvolver-se-á no verme adulto. De outra forma, o cisto primário fértil pode romper-se e extravazar seu conteúdo no interior do hospedeiro intermediário, o que induz os PSCs à formação de cistos hidáticos secundários. Embora existam vários relatos na literatura acerca da utilização de proteínas como biomarcadores para fases de desenvolvimento em outras espécies, pouco é conhecido sobre os mecanismos envolvidos nessa plasticidade do parasito. Uma opção de estudo está na resposta do parasito a um evento indutor, sendo interessante a marcação de proteínas recém-sintetizadas (PRS), realizada com aminoácidos radioativos ou, mais recentemente, com a utilização de aminoácidos artificiais. Dessa forma, o presente estudo visa melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento estrobilar de E. granulosus, através da análise de PRS nos PSCs com a incorporação do aminoácido artificial azido-homoalanina (AHA). Para isso, estudamos diferentes condições para a diferenciação estrobilar de PSCs in vitro e a incorporação de AHA, utilizando um tratamento inicial com pepsina seguido por cultivo em meio bifásico contendo taurocolato. Dessa forma, foi possível visualizar alterações morfológicas características da estrobilização já descritas na literatura, como a diminuição no número de corpúsculos calcários e a formação do canal excretor e bexiga. Após 72 h de incubação dos PSCs em meio bifásico suplementado com AHA, as PRS foram extraídas e marcadas com tetrametilrodamina. A eficiência da incorporação da AHA foi confirmada por SDS-PAGE 12% e visualização com luz ultravioleta, resultando num padrão de bandas complexo, com proteínas de 10 a 225 kDa, sendo este o primeiro relato de marcação e detecção de PRS com AHA em platelmintos. / The Echinococcus granulosus is a parasite of Class Cestoda, which causes cystic hydatid disease. During its life cycle in the intermediate host (sheep or cattle and accidentally man), initiates the formation of a hydatid cyst, which contains the pre-adult form of the parasite, the protoescolex (PSC). When ingested by a definitive host (usually the domestic dog), the PSC will develop into the adult worm. Another possibility is the rupture of the primary fertile cyst, releasing PSCs in the intermediate host, which may develop into secondary hydatid cysts. Although there are several reports in the literature about the use of proteins as biomarkers for developmental stages, little is known about the mechanisms involved in the plasticity of E. granulosus. A possible way to study this process is to analyze the parasite response to an inducing event, by labeling newly synthesized proteins (NSP), using radioactive amino acids or, more recently, artificial amino acids. This study aims to better understand the molecular mechanisms involved in the estrobilar development of E. granulosus by analyzing NSP in PSCs with the incorporation of the artificial amino acid azidohomoalanine (AHA). For this purpose, we have used different methods for cultivation that led to the in vitro PSCs’ estrobilar differentiation with an initial pepsin treatment, followed by cultivation in biphasic medium containing taurocholate. Using this procedure, it was possible to observe the morphological changes characteristic of the strobilation stages already described in the literature, such as the decrease in the number of calcareous corpuscles or the visualization of the excretory canal and the bladder. Following incubation of PSCs in biphasic medium supplemented with AHA, the NSP were extracted and labeled with tetramethylrhodamine. The incorporation efficiency of AHA was confirmed by analysis on 12% SDS-PAGE and exposure to UV light, showing a complex pattern of bands, with proteins between 10-225 kDa. This is the first report of labeling and detection of NSP with AHA in flatworms.

A hidatidose cística é uma zoonose helmíntica endêmica causada pela infecção com a forma larval ou metacestódeo de Echinococcus granulosus. Neste trabalho, foi realizada uma análise proteômica do metacestódeo de E. granulosus durante a infecção do seu hospedeiro intermediário bovino. A identificação de proteínas do parasito e do hospedeiro presentes nos diferentes componentes da larva do parasito (protoescólices, camada germinativa e líquido hidático) gerou informações valiosas sobre a relação parasitohospedeiro. Os resultados obtidos permitiram a caracterização da resposta imune montada pelo hospedeiro contra a infecção por E. granulosus, bem como de potenciais estratégias moleculares adotadas pelo parasito para evadir essa resposta e promover a sua sobrevivência dentro do corpo do hospedeiro. Além disso, novas proteínas-alvo foram identificadas para o desenvolvimento ou melhora de ferramentas de diagnóstico, tratamento e controle da hidatidose. Nesse trabalho, foi também estudada a estrutura do antígeno B (AgB) de E. granulosus, uma proteína implicada em múltiplas interações parasito-hospedeiro durante a infecção. Medidas de espalhamento de luz dinâmico utilizando subunidades recombinantes (AgB8/1, AgB8/2 e AgB8/3) demonstraram que o AgB forma diferentes estruturas moleculares sob condições fisiológicas, incluindo oligômeros e agregados de alta massa molecular. As subunidades recombinantes do AgB mostraram diferentes tendências agregativas, sendo os agregados de alta massa molecular formados por AgB8/3 os mais similares, em morfologia e tamanho, àqueles do AgB produzido pelo parasito. Experimentos de dissociação induzida por pressão revelaram que a formação de pontes dissulfeto confere maior estabilidade aos homo-oligômeros de AgB8/2 e AgB8/3. A composição de subunidades do AgB foi avaliada por espectrometria de massas (MS), identificando as subunidades AgB8/1, AgB8/3 e AgB8/4, o que indica uma contribuição principal dessas subunidades nas propriedades estruturais, biológicas e imunológicas do AgB de E. granulosus. A análise de MS indicou também uma associação entre AgB e Ag5, os principais antígenos secretados pelo metacestódeo de E. granulosus. / Cystic hydatid disease (CHD) is an endemic helminthic zoonosis caused by infection with the larval stage or metacestode of the tapeworm Echinococcus granulosus. Here, we performed a proteomic analysis of the E. granulosus metacestode during infection of its intermediate bovine host. Identification of parasite and host proteins present in different components of parasite larvae (protoscoleces, germinal layer and hydatid cyst fluid) provided valuable information on host-parasite interplay. Our results allowed the characterization of host immune response mounted against E. granulosus infection, as well as potential molecular strategies adopted by the parasite to avoid this response and promote its survival inside the host body. Moreover, new protein targets were identified for the development or improvement of CHD diagnosis, treatment, and control tools. In this work, we also study the structure of E. granulosus antigen B (AgB), a protein implicated in multiple host-parasite interactions during infection. Dynamic light scattering experiments with recombinant subunits (AgB8/1, AgB8/2 and AgB8/3) demonstrated that AgB form different molecular assemblies under physiological conditions, including oligomers and high-molecular-weight aggregates. AgB recombinant subunits showed different aggregative tendencies, being AgB8/3 high-molecular-weight aggregates most similar, both in morphology and size, to those of parasite-produced AgB. Pressure-induced dissociation experiments revealed that disulfide bonds formation confers greater stability to AgB8/2 and AgB8/3 homo-oligomers. AgB subunit composition was evaluated by mass spectrometry (MS), identifying AgB8/1, AgB8/3 and AgB8/4 subunits, which indicates a major contribution for these subunits on E. granulosus AgB structural, biological, and immunological properties. The MS analysis also indicated an association between AgB and Ag5, the major antigens secreted by E. granulosus metacestode.

A expressão “proteínas moonlighting” refere-se a um subgrupo de proteínas multifuncionais, onde duas ou mais funções são realizadas por uma mesma cadeia polipeptídica. Dentre as proteínas com funções moonlighting estão diversas enzimas glicolíticas que podem desempenhar papeis importantes em processos-chave na biologia de organismos parasitas, como os de motilidade, adesão, invasão e diferenciação. A aldolase, a enolase e a lactato-desidrogenase (LDH) estão entre as enzimas que foram detectadas nos produtos de excreção-secreção (ES) e em tecidos de interface com o hospedeiro de Echinococcus granulosus, o cestódeo causador da hidatidose cística em seres humanos e ungulados domésticos. Neste contexto, a caracterização destas enzimas pode revelar possíveis funções moonligthing por elas desempenhadas e contribuir para a compreensão de aspectos básicos do desenvolvimento do parasito e de possíveis mecanismos de interação com os hospedeiros. Inicialmente, as sequências codificadoras da aldolase (EgAldo), da enolase (EgEno) e da LDH (EgLDH) de E. granulosus foram amplificadas por RT-PCR, clonadas em um vetor de expressão modificado (pGEX-TEV) e expressas em Escherichia coli, para a produção das proteínas recombinantes correspondentes (rEgAldo, rEgEno e rEgLDH, respectivamente). Soros de pacientes humanos com hidatidose reconhecem, em imunoblots, a EgAldo e EgEno nativas mas não reconhecem as proteínas recombinantes correspondentes, sugerindo o envolvimento de epitopos não proteicos no reconhecimento desses antígenos. Antissoros policlonais contra a rEgAldo e a rEgEno evidenciaram, em protoescólices, uma localização predominantemente citoplasmática para as proteínas nativas cognatas. Elas também foram detectadas na camada germinativa e no líquido hidático, que representam interfaces entre o parasito e o hospedeiro. Além disso, tanto a EgAldo como a EgEno foram reconhecidas em frações de proteínas tegumentares e em produtos de ES de protoescólices, localizações sugestivas de funções moonlighting. Proteínas do parasito e do hospedeiro intermediário que interagem com as proteínas rEgAldo, rEgEno e rEgLDH foram recuperadas por experimentos de GST pull-down para posterior identificação destas proteínas por espectrometria de massas. A identificação destas proteínas de interação poderá apontar processos não-glicolíticos nos quais estas enzimas estejam envolvidas. / The term “moonlighting proteins” refers to a subset of multifunctional proteins in which two or more different functions are performed by one polipeptide chain. Among the proteins described as moonlighting, there are many glycolytic enzymes that play important roles in key processes in the biology of parasites, such as motility, adhesion, invasion and cell differentiation. Aldolase, enolase and lactate dehydrogenase are among the enzymes that have been detected in the excretory-secretory (ES) products and in the host-interacting metacestode components from Echinococcus granulosus, a cestode that causes cystic hydatid disease and affects both humans and livestock. In this context, the characterization of these enzymes may reveal possible moonlighting functions they perform and contribute to the understanding of basic aspects of the parasite development and differentiation and possible interaction mechanisms with the intermediate host. Initially, the complete coding sequences from E. granulosus aldolase (EgAldo), enolase (EgEno) and lactate dehydrogenase (EgLDH) were amplified by RT-PCR, cloned into a modified expression vector (pGEX-TEV) and expressed in Escherichia coli for recombinant proteins production (rEgAldo, rEgEno and rEgLDH, respectively). Sera from human hydatid disease patients recognize in immunoblots the native EgAldo and EgEno, but not its recombinant counterparts, which was taken as evidence of involvement of non proteic epitopes in the EgAldo and EgEno recognition. Polyclonal antiserum against rEgAldo and rEgEno have shown, in protoscoleces, a predominantly cytoplasmic localization for the cognate native proteins, as expected for glycolytic enzymes. They have also been detected in the germinal layer and hydatid fluid, which represent host-parasite interfaces. Furthermore, both EgAldo and EgEno were recognized in protoscoleces tegument extracts and in ES products from these parasites in culture, which are indicative of moonlighting functions. Parasite and intermediate host proteins that interact with proteins rEgAldo, rEgEno and rEgLDH in vitro were recovered by GST pull-down assays and the identification of these proteins will be performed using mass spectrometry. Identification of interacting proteins may also be an indication that these enzymes perform nonglycolytic functions.

O termo proteoformas refere-se a todas as formas moleculares na qual variantes proteicas codificadas por um único gene podem ser encontradas, incluindo mudanças devido a variação genética, splicing alternativo e modificações cotraducionais e póstraducionais (MCTs e MPTs, respectivamente). Em Echinococcus granulosus, o agente causador da hidatidose cística, a caracterização de proteoformas ainda não foi sistematicamente abordada e pode revelar mecanimos moleculares relevantes para o estabelecimento do parasito nos hospedeiros intermediários. A caracterização tanto de proteoformas da frutose-bifosfato-aldolase (FBA) e enolase, potencialmente moonlighting, como de outras proteoformas expressas em frações subcelulares do estágio larval deste parasito foi realizada. Em relação às enzimas glicolíticas, várias evidências indicam a EgFBA1 e a EgEno1 como sendo proteínas moonlighting: (i) as localizações não usuais destas proteínas no tegumento de protoescólices e em produtos de excreção/secreção (ES) in vivo (líquido hidático) e in vitro; (ii) características estruturais destas proteínas, com destaque para a identificação de um sítio de ligação à F-actina na estrutura da EgFBA1; (iii) a habilidade destas proteínas de interagirem com várias proteínas não relacionadas à glicólise. Em relação ao repertório de proteínas expressas em frações subcelulares, frações nucleares e citosólicas de protoescólices de E. granulosus foram analisadas através de proteômica top down e bottom up. De modo geral, 525 proteínas foram identificadas, sendo 224 e 156 proteínas exclusivamente detectadas em frações nucleares e citosólicas, respectivamente. Além da identificação de proteínas, nossa abordagem de proteômica top down também permitiu a caracterização de MCTs e MPTs, destacando a excisão da metionina N-terminal e a acetilação N-terminal como modificações conservadas nas proteínas de E. granulosus. Nossos resultados representam as primeiras evidências de funções alternativas realizadas por enzimas glicolíticas em E. granulosus e sugerem que proteínas multifuncionais devem desempenhar papéis importantes na interação parasitohospedeiro. Os proteomas nuclear e citosólico de protoescólices também foram descritos, revelando novos aspectos da biologia do parasito, incluindo proteoformas com MCTs e MPTs, as quais devem desempenhar papéis críticos na regulação de processos celulares deste parasito. / The term proteoforms refers to all molecular forms in which the protein product of a single gene can be found, including changes due to genetic variation, alternatively spliced RNA transcripts and co-translational and post-translational modifications (CTMs and PTMs, respectively). In Echinococcus granulosus, the causative agent of hydatid disease, the characterization of proteoforms has never been systematically addressed and it may reveal molecular mechanisms underlying the parasite biology. Here, the characterization of fructose-bisphosphate aldolase (FBA) and enolase proteoforms, potentially moonlighting, and also, the identification and characterization of proteoforms expressed in subcellular fractions of E. granulosus larval stage were performed. In relation to the glycolytic enzymes, several evidences indicate EgFBA1 and EgEno1 as moonlighting proteins: (i) their unusual locations in protoscolex tegument and in in vivo (hydatid fluid) and in vitro excretory/secretory (ES) products; (ii) their structural features, highlighting the F-actin binding site in the EgFBA1 structure; (iii) their ability to interact with several proteins non-related to glycolysis. In relation to the repertoire of proteins expressed in subcellular fractions, nuclear and cytosolic fractions from E. granulosus protoscoleces were analyzed by top down and bottom up proteomics for protein identification and characterization. Altogether, 525 proteins were identified, with 224 and 156 proteins exclusively detected in nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. Besides protein identification, our top down approach also provided CTMs and PTMs characterization, highlighting N-terminal methionine excision and N-terminal acetylation as conserved modifications in E. granulosus proteins. Overall, our results provided the first experimental evidences of alternative functions performed by glycolytic enzymes in E. granulosus and suggested that multifunctional proteins might play important roles in hostparasite interplay. We also provided the description of nuclear and cytosolic proteomes which revealed new aspects of parasite biology, highlighting proteoforms with CTMs and PTMS which might be playing critical roles in regulating cellular processes occurring in this parasite species.