Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-27T12:20:20Z No. of bitstreams: 1 TeseRNF.pdf: 5131887 bytes, checksum: 5f32fa62636719671f0675a379d2cd24 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:55:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseRNF.pdf: 5131887 bytes, checksum: 5f32fa62636719671f0675a379d2cd24 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T19:55:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseRNF.pdf: 5131887 bytes, checksum: 5f32fa62636719671f0675a379d2cd24 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T19:55:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseRNF.pdf: 5131887 bytes, checksum: 5f32fa62636719671f0675a379d2cd24 (MD5) Previous issue date: 2016-01-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The search for new sustainable alternative energy sources has followed the increasing concerns with common welfare and fossil fuel shortage. In this context, Bioethanol is a good option and lignocellulosic biomass is an interesting way of obtaining it. The enzymatic conversion of lignocellulosic biomass in fermentable sugars still is a costly process, which makes characterization mechanisms indispensable to make it economically viable. Being of great importance in the lignocellulosic biomass convertion, β-glucosidases catalyzed reaction is the last step in the saccharification processes. Beta glucosidase hydrolyze non-reduced β-D-glycoside terminals, releasing β-D-glucose. GH 1 and GH 3 are the families of those most studied enzymes. However, structural and functional data from this GH 3 family of enzymes are still scarce. This work aimed at the biochemical and structural characterization of β-glucosidase from Bifidobacterium adolescentis (BaBgl). This enzyme has a catalytic domain (CCD) and a fibronectin III-like domain (FnIII) whose function is still unknown. Biochemical data showed optimal conditions for enzyme activity at pH from 6.0 to 6.5, temperature at 45 ° C and synthetic substrate specificity of 4-nitrophenyl- -Dglucopyranoside (pNPG). The values of kinetic parameters, KM and Vmax, were 0.32±0.03 mM e 0.37±0.01 nmol/min, respectively. The enzyme doesn’t have transglycosylation mechanisms, indicating only hydrolytic activity. Some monosaccharides such as xylose and galactose increased the enzyme activity significantly, while glucose and arabinose inhibited it. The crystal structural model of the BaBgl revealed an N-terminal domain with fold like a TIM barrel, an intermediate sandwich α / β domain and a third C-terminal like FnIII domain. In this work we also studied the transglycosylation mechanisms of two β-glucosidases from Trichoderma harzianum (ThBgl1 and ThBgl2). Both enzymes exhibit transglycosylation reaction but the ThBgl1 showed a hydrolysis/transglycosylation ratio lower than the one for ThBgl2. Crystallographic structures shows a typical folding for GH family 1 β-glucosidases, folding in the form of a TIM barrel (α / β)8. However, ThBgl2 has a more polar active site and therefore, favorites the interaction with water molecules, promoting better the hydrolysis reaction when compared to ThBgl1. / A preocupação ambiental e com a qualidade de vida da população aliados com o esgotamento dos combustíveis fósseis, tem aumentado a busca por energias alternativas e sustentáveis. Neste contexto, a hidrólise da biomassa lignocelulósica é uma opção interessante para obtenção de bioetanol. A utilização de enzimas para conversão da biomassa lignocelulósica a açúcares fermentescíveis ainda é um processo de custo elevado, o que torna imprescindível os estudos de caracterização dos mecanismos dessas enzimas afim de torná-las economicamente mais viáveis. A reação catalisada por β-glicosidases é a última etapa da sacarificação da celulose, sendo de grande relevância na conversão da biomassa ignocelulósica. β- glicosidases hidrolisam terminais não reduzidos β-D-glicosil liberando β-D-glicose e GH 1 e GH 3 são as famílias dessas enzimas mais estudadas. Entretanto dados estruturais e funcionais das enzimas da família GH 3, ainda são escassos. O presente trabalho apresenta a caracterização bioquímica e estrutural de uma β-glicosidase de Bifidobacterium adolescentis (BaBgl). Essa enzima possui um domínio catalítico (CCD) e um domínio do tipo fibronectina III (FnIII) cuja função ainda é desconhecida. Os dados bioquímicos revelaram condições ótimas para atividade da enzima em pH entre 6,0 e 6,5, temperatura de 45 °C e especificidade pelo substrato sintético 4- nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPG). Os parâmetros cinéticos KM e Vmáx apresentaram valores de 0,32±0,03 mM e 0,37±0,01 nmol/min respectivamente. A enzima não apresentou mecanismos de transglicosilação, indicando apenas atividade hidrolítica. Ensaios com monossacarídeos como xilose e galactose aumentaram significativamente a atividade enzimática enquanto que glicose e arabinose inibiram sua atividade. O modelo da estrutura cristalográfica da BaBgl revelou um domínio Nterminal enovelado como um barril TIM, um domínio intermediário na forma de sanduíche α/β e um terceiro domínio C-terminal do tipo FnIII. Neste trabalho também foram estudados os mecanismos de tranglicosilação de duas β-glicosidases de Trichoderma harzianum (ThBgl1 e ThBgl2), sendo que ambas realizam reação de transglicosilação, porém a ThBgl1 possui relação hidrólise/tranglicosilação menor que a ThBgl2. As estruturas cristalográficas demonstram um enovelamento típico para as β-glicosidases da família GH 1, com o enovelamento na forma de um barril TIM (α/β)8. Contudo, a ThBgl2 apresenta sítio ativo mais polar e portanto propício à interação com moléculas de água, favorecendo a reação de hidrólise quando comparada à ThBgl1.