Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal / Niveles elevados de aldosterona causan hipertensión arterial y un estado inflamatorio moderado en tejido renal y cardiovascular. La evidencia clínica y experimental ha demostrado que el bloqueo del receptor de aldosterona/mineralocorticoides (MR) reduce la inflamación tisular y la producción de diferentes citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, el perfil y la temporalidad de los fenómenos inflamatorios asociados a la activación del MR son poco conocidos. Estudios recientes han identificado una nueva vía inflamatoria, la vía IL-23/IL-17, que participa en el daño autoinmune en enfermedades inflamatorias del sistema digestivo y el sistema nervioso central. Además, estudios en modelos experimentales de autoinmunidad e hipertensión arterial indican que el desarrollo de inflamación se podría asociar a la disminución de la función de linfocitos reguladores (TregFoxP3+). En este trabajo estudiamos si la activación del MR mediante el tratamiento con deoxicorticosterona acetato y una dieta rica en sal (DOCA-sal) causa la activación del eje IL-23/IL-17 y/o modifica linfocitos Treg, en células mononucleares sanguíneas, bazo, corazón y en tejido renal. En una primera serie de experimentos evaluamos la cinética de activación de la vía IL-23/IL17 y el efecto de la activación y bloqueo del MR sobre esta vía inflamatoria. Estudiamos tres grupos de ratas uninefrectomizadas a 4, 8, 16 y 28 días, con los siguientes tratamientos: 1) Vehículo, 2) DOCA (0,5 mg/0,1kg) + 1% NaCl en la bebida (DOCA-sal), y 3) DOCA-sal + espironolactona (50 mg/kg/día). En una segunda serie experimental evaluamos si la activación de la vía IL-17/IL-23 era secundaria a la hipertensión (efecto hemodinámico) y/o la activación del MR, suministrando terapia antihipertensiva (triterapia) a los animales que recibían tratamiento DOCA-sal. Analizamos cuatro grupos experimentales 1) Vehículo, 2) DOCA-sal, 3) DOCA-sal+Triterapia antihipertensiva (Tri; Hidroclorotiazida 4 mg/kg/día, Reserpina 0,32 mg/kg./día, Hidralazina 6,5 mg/kg/día). En ambas series experimentales realizamos estudios fisiológicos, bioquímicos, de biología molecular, e histológicos para evaluar el desarrollo de hipertensión arterial, daño tisular y su correlación con la activación de la vía IL-23/IL-17. Al cuarto día de tratamiento DOCA-sal, se evidenció hipertensión arterial sistólica (159±8,3 mm Hg vs Vehículo 116±7,1 mm Hg, p<0,001), seguido al octavo día por un aumento de los ARNm de IL-17, TGF-β1 y RORγt (un factor de transcripción que determina la diferenciación Th17) en células mononucleares sanguíneas. Observamos efectos similares en el bazo de ratas DOCA-sal. Posteriormente, al día 16 de tratamiento, aumentó la abundancia renal y cardíaca de los ARNm de citoquinas que favorecen la polarización Th17 (IL-23 e IL-1β), coincidente con la expresión proteica de IL-17 y el infiltrado de linfocitos T CD4+/IL-17A+. El tratamiento con espironolactona previno el desarrollo de hipertensión arterial en animales tratados con DOCA-sal (117±8 mm Hg vs grupo DOCA-sal, p<0,001), el aumento en la expresión del ARNm de citoquinas pertenecientes al eje IL-23/IL-17 y la infiltración tisular por células T CD4+/IL-17A+en tejido renal. Además, espironolactona incrementó a los 8 días la abundancia del ARNm Foxp3. Al suministrar la triterapia antihipertensiva a ratas DOCA-sal observamos aunque este tratamiento previno efectivamente la hipertensión arterial, no bloqueó la polarización Th17. En base a los resultados obtenidos, se concluye que el proceso inflamatorio inducido por el tratamiento DOCA-sal implica la activación del eje inflamatorio Th17, tanto en células mononucleares sanguíneas como en tejido renal y cardiaco. La activación Th17 es prevenida por antagonista del MR espironolactona y no por el tratamiento anti-hipertensivo. Estos resultados indican que la activación del MR es necesaria para la polarización Th17 que caracteriza la hipertensión DOCA-sal y sugieren que el tratamiento con antagonistas farmacológicos del MR podría ser utilizado en clínica como una estrategia anti-inflamatoria en el tratamiento de la hipertensión arterial / High levels of aldosterone cause hypertension and moderate inflammatory state in renal and cardiovascular tissue. Clinical and experimental evidence has demonstrated that blocking aldosterone receptor (mineralocorticoid receptor, MR) reduces tissue inflammation and the production of several pro-inflammatory cytokines. However, the profile and timing of the inflammatory phenomena associated with MR activation are poorly understood. Recent studies have identified a new inflammatory axis, the IL-23/IL-17 pathway, which is involved in autoimmune damage in inflammatory diseases of the digestive system and the central nervous system. Furthermore, studies in experimental models of autoimmunity and hypertension indicate that the development of inflammation could be associated with reduced regulatory T lymphocytes (TregFoxP3+). We studied whether the activation of the MR by the treatment with deoxycorticosterone acetate plus high salt diet (DOCA-salt) causes the activation of the IL-23/IL-17 and/or modifies Treg in blood mononuclear cells, spleen, cardiac and renal tissue. In a first set of experiments, we evaluated the kinetics of IL-23/IL17 pathway activation, and the activation and effect of pharmacological blockade of the MR on IL-23/IL-17 pathway. We studied three groups of uninephrectomized rats at 4, 8, 16 and 28 days: 1) vehicle, 2) DOCA (0.5 mg/kg 0.1) + 0.9% NaCl in the beverage (DOCA-salt) and 3) DOCA-salt+spironolactone (50 mg/kg/day). In a second set of experiments, we evaluated whether IL-23/ IL-17 pathway activation is secondary to hypertension (hemodynamic effect) and/or activation of MR. We analyzed three experimental groups: 1) vehicle, 2) DOCA / salt, 3) DOCA-salt + antihypertensive tripletherapy (Tri; 4mg/kg/day Hydrochlorothiazide, Reserpine 0.32 mg/kg/day, Hydralazine 6.5 mg/kg/day). In both sets of experiments we evaluated the development of hypertension, tissue damage and its correlation with IL-23/IL-17 pathway activation. On the fourth day of DOCA-salt treatment, the rats the evidenced systolic hypertension (159 ± 8.3 mm Hg vs vehicle 116 ± 7.1 mm Hg, p < 0.001). At the eighth day, we observed an increase of IL-17, TGF-β1 and RORγt mRNAs in blood mononuclear cells. Similar results were observed in spleen samples from DOCA-salt rats. At day 16 of treatment, we observed increased abundance of renal and cardiac cytokines mRNAs that favors Th17 polarization (IL-23 and IL- 1β), that was coincident with increased expression of IL-17A protein and the appearance of CD4+ / IL-17A+ cell infiltrate. The treatment with spironolactone prevented the development of hypertension (117 ± 8 mm Hg vs group DOCAsalt, p < 0.001), the increase of cytokines transcripts and the cell infiltration. Furthermore, at 8 days of treatment, spironolactone increased the abundance of Foxp3 mRNA. The treatment of the DOCA-salt rats with antihypertensive therapy did not prevented the up regulation of IL-23/IL-17 pathway, although the Tri effectively prevented hypertension. Based on these results, it is concluded that the inflammatory process induced by DOCA-salt involves the activation of IL-23/IL-17 inflammatory axis in blood mononuclear cells, spleen, kidney and heart tissue. IL23/IL17 activation is depended on the MR activation and independent of hypertension. These results indicate that activation of the MR is required for the Th17 polarization caused by DOCA-salt treatment, and suggests the pharmacological treatment with MR antagonists (spironolactone, eplerenone) may be used clinically as an anti-inflammatory approach in the treatment of hypertension

Introdução: O hiperaldosteronismo primário (HP) é a causa mais comum de hipertensão arterial sistêmica (HAS) secundária, com prevalência de até 21% em pacientes com HAS resistente. Na última década, foram feitos consideráveis avanços na compreensão da patogênese do HP. Variantes patogênicas somáticas nos genes de canais iônicos KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1 e ATP2B3, envolvidos na manutenção da homeostase iônica intracelular, foram descritas em 38%, 9,3%, 5,3% e 1,7% dos tumores, respectivamente. Variantes patogênicas somáticas no gene CTNNB1, fundamental para o desenvolvimento do córtex da suprarrenal, foram também identificadas em aproximadamente 5% dos aldosteronomas. Mais recentemente, uma variante germinativa no gene CACNA1H, que codifica a subunidade Alfa1H do canal de cálcio Cav 3.2, foi identificada em um paciente com aldosteronoma. Objetivos: O objetivo geral desse projeto foi investigar as bases genéticas do HP causado por aldosteronoma. Os objetivos específicos foram: 1) Investigar variantes patogênicas somáticas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 em aldosteronomas de indivíduos com HP; 2) Sequenciar o exoma (pareado sangue e tumor) dos casos de HP causados por aldosteronoma, negativos para variantes nos genes citados acima; 3) Correlacionar o genótipo com os parâmetros clínicos e hormonais dos pacientes com aldosteronomas. Métodos: As regiões hot-spot dos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 foram sequenciadas por Sanger em 62 tumores [56% mulheres; mediana de idade ao diagnóstico 50 anos (variação, 20 a 68)]. Pacientes sem variantes patogênicas somáticas nos genes descritos acima foram submetidos a genotipagem do exoma (pareado sangue e tecido) por sequenciamento paralelo em larga escala (HiSeq 2500, Illumina). Variantes germinativas raras (MAF < 0,01% no 1000 genomes, ExAC, gnomAD e AbraOM) em genes codificadores de canais iônicos ou associados a hiperplasia adrenal foram selecionadas para segregação familial. Resultados: Variantes patogênicas somáticas em heterozigose foram encontradas em 34 de 62 (54,8%) aldosteronomas. As variantes identificadas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 eram previamente conhecidas. Variantes patogênicas no KCNJ5 foram detectadas em 28 de 62 (45,2%) aldosteronomas. Duas variantes recorrentes foram encontradas: p.Gly151Arg em 13 de 28 (46%) e p.Leu168Arg em 14 de 28 (50%) tumores. A variante patogênica p.Glu145Gln do KCNJ5 foi identificada em um (4%) aldosteronoma. Adicionalmente, a variante patogênica p.Leu104Arg do ATP1A1 foi detectada em 2 (3,2%) aldosteronomas; a variante patogênica p.Leu425_Val426del do ATP2B3 em um (1,6%) caso e a variante patogênica p.Ser45Pro do CTNNB1 em 2 (3,2%) aldosteronomas. Uma nova variante p.Leu276Pro somática em heterozigose no CACNA1D foi identificada em um aldosteronoma no exoma e classificada como provavelmente patogênica. Aldosteronomas com variantes patogênicas no KCNJ5 foram diagnosticados mais frequentemente em mulheres (p= 0,047) e em idades mais jovens (p= 0,002) quando comparado com tumores sem variantes no KCNJ5. O tamanho do nódulo foi maior em aldosteronomas com variantes patogênicas no KCNJ5 (p= 0,0001). O percentual de pacientes com tempo de HAS < 5 anos foi similar nos dois grupos. A remissão pós-operatória da HAS foi observada em 50% dos pacientes com tumor contendo variante patogênica no KCNJ5, enquanto apenas 15% dos pacientes com tumor sem variante no KCNJ5 tiveram remissão da HAS (p= 0,003). Na análise multivariada, somente a presença de variante patogênica somática no KCNJ5 foi um preditor independente de remissão da HAS (p= 0,03). Após filtragem das variantes encontradas no sequenciamento exômico, quatro variantes germinativas missense em heterozigose foram consideradas deletérias em mais de 3 algoritmos de predição in silico: 1) uma nova variante (p.Pro559Thr) no gene CACNA1H, já associado ao fenótipo de HP; 2) a variante p.Arg178Cys no gene CACNA1I, que codifica a subunidade Alfa 1I do canal Cav 3.3; 3) a variante p.Glu52Ala no gene ATP13A3, que codifica uma proteína transmembrana da família de proteínas ATPase do tipo P; 4) a variante p.Tyr507Ser no gene KCNC4, que codifica o canal de potássio Kv 3.4. Conclusão: Foi caracterizado o espectro de variantes patogênicas somáticas em uma coorte brasileira de tumores corticais adrenais produtores de aldosterona, bem como o impacto das variantes no KCNJ5 na predição de remissão da HAS após adrenalectomia. Além disso, foram identificados novos genes candidatos provavelmente relacionados a patogênese do HP causado por aldosteronomas / Introduction: Primary aldosteronism (PA) is the most common form of secondary hypertension (HT), with a prevalence of approximately 20% in patients with resistant hypertension. In the last decade, somatic mutations in KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1 and ATP2B3 genes, which are involved in maintaining intracellular ionic homeostasis and cell membrane potential, were described in 38%, 9.3%, 5.3% and 1.7% of aldosterone-producing adenomas (APAs), respectively. All these mutations lead to the activation of calcium signaling, the major trigger for aldosterone production. Additionally, somatic activating mutations in exon 3 of CTNNB1 gene, which is involved in the adrenocortical development, were identified in approximately 5% of APAs. More recently, the germline p.V1951G CACNA1H variant was described in a PA patient with an APA. Aims: To investigate the genetics of APAs. The specific aims of this study were: 1) To investigate somatic variants in KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1 genes in APAs from PA patients; 2) To perform exome sequencing of PA patients caused by APAs without mutations in those genes already associated with PA; 3) To correlate genetic findings and clinical parameters. Methods: Hot-spot regions of KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 genes were sequenced by Sanger in 62 APAs [56% women; median of age at diagnosis 50 yrs (range, 20 to 68)]. We performed whole exome sequencing (HiSeq 2500, Illumina) in paired blood and tumor DNA samples from 10 unrelated subjects with PA caused by APAs without somatic mutations in hot-spot regions of KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1.We searched for rare germline coding variants (MAF < 0.01% in 1000 genomes, ExAC, gnomAD and AbraOM) in ionchannel genes, which are expressed in normal adrenal tissue, or in genes previously related to adrenal hyperplasia. Results: Pathogenic somatic heterozygous variants were identified in 34 out of 62 (54.8%) APAs. KCNJ5 pathogenic variants were detected in 28 out of 62 (45.2%) APAs. Two recurrent variants were found in KCNJ5: the p.Gly151Arg in 13 out of 28 (46%) and the p.Leu168Arg in 14 out of 28 (50%) APAs. KCNJ5 pathogenic variant p.Glu145Gln was identified in one (4%) APA. In addition, the p.Leu104Arg ATP1A1 mutation was detected in two APAs (3.2%); the p.Leu425_Val426del ATP2B3 mutation in one APA (1.6%); and the p.Ser45Pro CTNNB1 mutation in two APAs (3.2%). The novel CACNA1D somatic heterozygous variant p.Leu276Pro (likely pathogenic) was identified by exome sequencing in one APA. APAs with KCNJ5 pathogenic variants were diagnosed more often in women (p= 0.047) and at younger ages (p= 0.002) when compared to APAs without KCNJ5 variants. Nodule size was larger in APAs with KCNJ5 pathogenic variants (p= 0.0001). The frequency of PA patients com HT duration < 5 yrs was similar in both groups. HT remission was observed in 50% of patients with APAs harboring KCNJ5 pathogenic variants, whereas only 15% of patients with APAs without KCNJ5 pathogenic variants had HT remission (p= 0.003). In multivariate analysis, only the presence of a KCNJ5 pathogenic variant was an independent predictor of HT remission (p= 0.03). After exome sequencing analysis, four germline missense heterozygous variants predicted to be pathogenic in >=3 in silico tools were selected: 1) the novel p.Pro559Thr variant in CACNA1H gene, previously associated with PA phenotype; 2) the p.Arg178Cys variant in CACNA1I gene, which encodes the Alpha 1I subunit of Cav 3.3 channel; 3) the p.Glu52Ala variant in ATP13A3 gene, which is a member of the P-type ATPase family of membrane transport proteins; and 4) the p.Tyr507Ser variant in KCNC4 gene, which encodes the voltage-gated potassium channel Kv 3.4. Conclusion: We have characterized the spectrum of somatic pathogenic variants in a Brazilian cohort of APAs, and evaluated the impact of KCNJ5 somatic pathogenic variants in predicting HT remission after adrenalectomy. In addition, we identified potential novel gene candidates in the pathogenesis of PA caused by APAs