Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-07T15:34:43Z No. of bitstreams: 1 2017_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 2680968 bytes, checksum: 8580b3b573218ef34ac470e14ff48768 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-04T21:08:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 2680968 bytes, checksum: 8580b3b573218ef34ac470e14ff48768 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-04T21:08:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CarolinaGonzalesdaSilva.pdf: 2680968 bytes, checksum: 8580b3b573218ef34ac470e14ff48768 (MD5) Previous issue date: 2018-06-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / O sucesso da clonagem por transferência nuclear (TN) está diretamente relacionado ao status epigenético da célula doadora de núcleo. Quanto menos diferenciada a célula, mais fácil é a reprogramação nuclear a um estado embrionário. Da mesma forma, o uso de drogas que atuem nos mecanismos de regulação epigenética, tal como a Tricostatina A (TSA), ajudam nessa reprogramação. O objetivo desse trabalho foi realizar a caracterização epigenética de três tipos de células doadoras de núcleo, sendo elas células-tronco mesenquimais (CTM) provenientes de duas fontes: fluido amniótico (CTM-FA) e tecido adiposo (CTM-TA), e fibroblastos (FIB) da orelha de bovinos; testar o efeito de sua utilização na TN com e sem a adição de TSA; verificar a expressão de genes ligados à epigenética: KAT2A, HDAC1 e HDAC3. Para isso, foram coletas CTM-FA por amniocentese in vivo de dois bovinos (BOV 1 e BOV 2) da raça Gir durante a gestação. Após o nascimento, foram realizadas biópsias de tecido adiposo e pele para isolamento de CTM-TA e FIB, respectivamente. As células foram cultivadas em incubadora a 38,5°C, 5% de CO2 e umidade elevada. Após isolamento, as células foram utilizadas para caracterização de sua origem mesenquimal por meio de marcadores de superfície celular verificados por citometria de fluxo e capacidade de diferenciação em adipócitos, condrócitos e osteócitos. O DNA genômico de todos os tipos celulares foi extraído pelo método de salting out e os status de metilação e hidroximetilação global do DNA foram determinados utilizando os kits MethylFlashTM Methylated DNA Quantification (Colorimetric) e MethylFlashTM Hydroxymethylated DNA Quantification (Colorimetric) (Epigentek), respectivamente. Para a clonagem, ovários foram coletados de abatedouros-frigoríficos para isolamento de ovócitos, que foram submetidos a 18 horas de maturação in vitro. Após a maturação os ovócitos foram enucleados e a célula doadora foi inserida no espaço perivitelínico. Para incorporação da célula ao citoplasma ovocitário, foi realizada a eletrofusão e então, os citoplastos foram submetidos ao cultivo com 50 nM de TSA por 20 h ou em meio sem a TSA. Após sete e oito dias de cultivo a taxa de produção de embriões foi calculada e comparada pelo teste de Tukey (p < 0,05). As culturas celulares das células provenientes do tecido adiposo e do fluido amniótico exibiram os marcadores típicos de CTM na maior porcentagem das células. Observaram-se resultados opostos entre os animais para a metilação do DNA, pois no animal BOV1, as CTM mostraram-se mais metiladas que os FIB, ao contrário do animal BOV2 onde FIB foram mais metilados que as células-tronco. Já o resultado de hidroximetilação seguiu o mesmo padrão para todas as células nos animais BOV1 e BOV2, respectivamente, sendo que CTM-FA foram as menos hidroximetiladas (0,008 e 0,002%), seguidas de FIB (0,013 e 0,009%) e CTM-TA (0,072 e 0,03%). Ao analisar as taxas de produção de embriões com sete dias de desenvolvimento, para o animal BOV1 nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os tratamentos. Já para o animal BOV2, as CTM-FA produziram 44,92 ± 8,88% de blastocistos clonados quando os embriões foram expostos a 20 h com a TSA. Esse resultado foi superior a todos os outros tratamentos sem a TSA e semelhante ao tratamento com CTM-TA também com uso da TSA (37,96 ± 15,80%). Os embriões produzidos a partir das CTM-FA do BOV2 expressaram menos HDAC3 quando foram tratados com TSA, além disso, quando não foi utilizada TSA no cultivo, os embriões reconstruídos com FIB apresentaram menor expressão, semelhante aos embriões reconstruídos com CTM-TA. Por fim, a expressão de KTA2A foi maior em embriões tratados com TSA por 20 h quando foram utilizadas CTM, independente da fonte, como doadoras de núcleo. Estes resultados demonstram que quando as CTM foram menos metiladas que FIB, sua associação com TSA foi efetiva em aumentar a produção dos embriões bovinos clonados, entretanto, em contraste, quando as CTM foram mais metiladas sua associação com TSA gerou embriões numa proporção estatisticamente semelhante àquela obtida com CTM na ausência de TSA. Ademais, o uso da TSA foi efetivo em reduzir a expressão da HDAC3 quando CTM-FA foram utilizadas. / The success of cloning by Nuclear Transfer (NT) is directly related to the epigenetic status of the nucleus donor cell. The less differentiated is the cell, the easier is nuclear reprogramming to an embryonic state. Likewise, the use of drugs acting on mechanisms of epigenetic regulation, such as Trichostatin A (TSA), would aid in reprogramming. The objective of this work was to perform the epigenetic characterization of three types of donor nucleus cells, being mesenchymal stem cells (MSC) from two sources: amniotic fluid (MSC-AF) and adipose tissue (MSC-AT), and fibroblasts (FIB) of bovine ear; test the effect of its use on NT with and without the addition of TSA; to verify the expression of genes linked to epigenetics: KAT2A, HDAC1 and HDAC3. For this, MSC-AF samples were collected by amniocentesis in vivo of two Gyr cows (BOV 1 and BOV 2) during gestation. After birth, adipose tissue and skin biopsies were collected for isolation of MSC-AT and FIB, respectively. Cells were grown in incubator at 38.5°C, 5% CO2 and elevated humidity. After isolation, the cells were used to characterize their mesenchymal origin by means of cell surface markers verified by flow cytometry and differentiation capacity in adipocytes, chondrocytes and osteocytes. The genomic DNA of all cell types was extracted by the salting out method and the methylation and hydroxymethylation status of the DNA were determined using the MethylFlash ™ Methylated DNA Quantification (Colorimetric) and MethylFlash ™ Hydroxymethylated DNA Quantification (Colorimetric) (Epigentek) kits, respectively. For cloning, ovaries were collected from slaughterhouses to isolate oocytes, which were submitted to 18 hours of in vitro maturation. After maturation, the oocytes were enucleated and the donor cell was inserted into the perivitelinic space. For incorporation of the cell into the oocyte cytoplasm, electrofusion was performed and then the cytoplasts were cultured with 50 nM TSA for 20 h or in medium without TSA. After seven and eight days of culture the rate of embryo production was calculated and compared by Tukey's test (p <0.05). Cellular cultures of cells from adipose tissue and amniotic fluid exhibited typical MSC markers in the highest percentage of cells. Opposite results were observed among the animals for DNA methylation, because in the BOV1, the MSC were more methylated than the FIB, unlike the BOV2 where FIB were more methylated than the MSC. The hydroxymethylation result followed the same pattern for all cells: MSC-AF were the least hydroxymethylated (0.008 and 0.002%), followed by FIB (0.013 and 0.009%) and MSC-AT (0.072 and 0.03%), respectively for BOV1 and BOV2. When analyzing the production rates of embryos with seven days of development, for the BOV1 no significant difference was found between the treatments. For the BOV2, the MSC-AF produced 44.92 ± 8.88% of cloned blastocysts when the embryos were exposed at 20 h with TSA. This result was superior to all other treatments without TSA and similar to treatment with MSC-AT also using TSA (37.96 ± 15.80%). Embryos produced from the BOV2 with MSC-AF expressed less HDAC3 when treated with TSA; in addition, when TSA was not used in the culture, the embryos reconstructed with FIB presented lower expression, similar to embryos reconstructed with MSC-AT. Finally, KTA2A expression was higher in TSA treated embryos for 20 h when MSC, regardless of source, were used as donor nuclei. These results demonstrate that when MSC was less methylated than FIB, its association with TSA was effective in increasing the production of cloned bovine embryos, however, in contrast, when MSC was more methylated its association with TSA generated embryos in a ratio statistically similar to that obtained with MSC in the absence of TSA. In addition, the use of TSA was effective in reducing the expression of HDAC3 when MSC-AF were used.