O linfoma de células do manto é associado à translocação t(11;14)(q13;q32) e à hiperexpressão da ciclina D1. Os pacientes com linfoma de células do manto apresentam-se com doença avançada ao diagnóstico e a fase leucêmica da doença é observada em cerca de um terço dos casos. Os linfócitos B virgens pré-centro germinativo, que ocupam a zona do manto dos folículos linfóides secundários, constituem a origem celular do linfoma de células do manto. A hiperexpressão da ciclina D1, por si só, não é suficiente para a patogênese da neoplasia, e a elucidação das alterações moleculares adicionais poderá fundamentar novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, os métodos de estudo do perfil de expressão gênica em larga escala têm potencial para auxiliar na descoberta dessas alterações moleculares adicionais. Todavia, nos estudos que empregaram esses métodos até o momento, o material genético foi obtido de amostras de gânglios acometidos pelo tumor, que contêm uma proporção variável de células normais do estroma do tecido linfóide. Por isso, ainda não se sabe quais dos genes identificados como alterados no linfoma de células do manto são específicos das células linfomatosas, e quais são dependentes das células normais que perfazem o estroma do gânglio. Com o objetivo de elucidar as alterações moleculares do linfoma de células do manto em nível celular, realizamos um estudo comparativo entre o perfil de expressão gênica de células linfomatosas purificadas e de linfócitos B virgens, utilizando microarrays de oligonucleotídeos. Células linfomatosas e linfócitos B virgens (IgD+CD38±CD27-) foram purificados em colunas magnéticas a partir do sangue periférico de pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica e de amígdalas de indivíduos normais, respectivamente (pureza > 95%). Três indivíduos foram selecionados em cada grupo e os experimentos foram realizados em duplicatas usando microarrays comerciais modelo CodeLink Human UniSet I, com 10.000 genes. Foram identificados 106 genes com variação de expressão maior do que três vezes, 63 deles induzidos e 43 reprimidos no linfoma de células do manto em relação aos linfócitos B virgens. Dez genes (seis induzidos e quatro reprimidos) foram selecionados para quantificação, por RT-PCR em tempo real, em amostras de sangue periférico de 21 pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica, além de 14 pacientes com outras doenças linfoproliferativas crônicas e de sete indivíduos sem doenças neoplásicas. Os resultados dos experimentos com microarrays foram confirmados pela quantificação por RT-PCR em tempo real em todos os 10 genes selecionados e os valores de expressão do gene TLR1 obtidos por esse método demonstraram correlação significativa com a sobrevida dos pacientes com linfoma de células do manto. Além de identificar vários genes modulados no linfoma de células do manto em nível celular, este estudo também revelou a expressão aberrante de diversos genes relacionados à apoptose e às vias de sinalização PI3K/AKT, WNT e TGFβ. Esses resultados adicionam informações originais à patogênese molecular do linfoma de células do manto e apontam para vias específicas de sinalização molecular como potenciais alvos para novas abordagens terapêuticas. / Mantle cell lymphoma is associated with the translocation t(11;14)(q13;32) and overexpression of cyclin D1. Mantle cell lymphoma is predominantly disseminated at diagnosis and a frank leukemic phase is detected in one third of patients. The pre-germinal-center naive B-cells, which populate the mantle zone of the secondary lymphoid follicles, are the cells of origin of mantle cell lymphoma. Overexpression of cyclin D1 is not sufficient by itself to cause lymphoma, and a better understanding of the additional molecular lesions may provide insights toward new therapeutic approaches. In this context, large scale gene expression studies may be useful in the investigation of such additional molecular lesions. However, the great majority of mantle cell lymphoma cases studied by these methods to date had the genetic material harvested from lymph nodes, which have a variable proportion of normal cells from the lymphoid stroma. It is therefore not known how many genes identified as differentially expressed in mantle cell lymphoma by tumor versus normal experiments are cell-autonomous rather than dependent on the tumor microenvironment. To address this issue, we compared the gene expression profile of mantle cell lymphoma cells and normal naive B-cells using oligonucleotide microarrays. Lymphoma cells and naive B-cells (IgD+CD38±CD27-) were highly purified, by magnetic activated cell sorting, from the peripheral blood of patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase and from tonsils of normal individuals, respectively (purity > 95% in all samples). Three individuals were selected for each group and experiments were performed in replicates using the Amersham CodeLink Human UniSet I Bioarrays, with 10,000 genes. We identified 106 genes differentially expressed with a fold change of at least three-fold, 63 induced and 43 repressed in mantle cell lymphoma in comparison with naive B-cells. Ten genes were selected (six induced and four repressed in lymphoma cells) for quantification by real-time RT-PCR in non-purified peripheral blood samples from 21 patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase, as well as in 14 patients with other chronic lymphoproliferative diseases and seven normal individuals. Microarray results were confirmed by real-time RT-PCR for all selected genes and expression values of the TLR1 gene as quantified by this method showed significant correlation with patient survival in mantle cell lymphoma. In addition to the identification of several modulated genes in mantle cell lymphoma at cellular level, this study revealed that some genes functionally connected through apoptosis or the PI3K/AKT, WNT and TGFβ signaling pathways are aberrantly expressed in mantle cell lymphoma. These results add original data to the molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma and point to specific molecular signaling pathways related to inhibition of apoptosis as potential targets for new therapeutic approaches.

O linfoma de células do manto é associado à translocação t(11;14)(q13;q32) e à hiperexpressão da ciclina D1. Os pacientes com linfoma de células do manto apresentam-se com doença avançada ao diagnóstico e a fase leucêmica da doença é observada em cerca de um terço dos casos. Os linfócitos B virgens pré-centro germinativo, que ocupam a zona do manto dos folículos linfóides secundários, constituem a origem celular do linfoma de células do manto. A hiperexpressão da ciclina D1, por si só, não é suficiente para a patogênese da neoplasia, e a elucidação das alterações moleculares adicionais poderá fundamentar novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, os métodos de estudo do perfil de expressão gênica em larga escala têm potencial para auxiliar na descoberta dessas alterações moleculares adicionais. Todavia, nos estudos que empregaram esses métodos até o momento, o material genético foi obtido de amostras de gânglios acometidos pelo tumor, que contêm uma proporção variável de células normais do estroma do tecido linfóide. Por isso, ainda não se sabe quais dos genes identificados como alterados no linfoma de células do manto são específicos das células linfomatosas, e quais são dependentes das células normais que perfazem o estroma do gânglio. Com o objetivo de elucidar as alterações moleculares do linfoma de células do manto em nível celular, realizamos um estudo comparativo entre o perfil de expressão gênica de células linfomatosas purificadas e de linfócitos B virgens, utilizando microarrays de oligonucleotídeos. Células linfomatosas e linfócitos B virgens (IgD+CD38±CD27-) foram purificados em colunas magnéticas a partir do sangue periférico de pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica e de amígdalas de indivíduos normais, respectivamente (pureza > 95%). Três indivíduos foram selecionados em cada grupo e os experimentos foram realizados em duplicatas usando microarrays comerciais modelo CodeLink Human UniSet I, com 10.000 genes. Foram identificados 106 genes com variação de expressão maior do que três vezes, 63 deles induzidos e 43 reprimidos no linfoma de células do manto em relação aos linfócitos B virgens. Dez genes (seis induzidos e quatro reprimidos) foram selecionados para quantificação, por RT-PCR em tempo real, em amostras de sangue periférico de 21 pacientes com linfoma de células do manto em fase leucêmica, além de 14 pacientes com outras doenças linfoproliferativas crônicas e de sete indivíduos sem doenças neoplásicas. Os resultados dos experimentos com microarrays foram confirmados pela quantificação por RT-PCR em tempo real em todos os 10 genes selecionados e os valores de expressão do gene TLR1 obtidos por esse método demonstraram correlação significativa com a sobrevida dos pacientes com linfoma de células do manto. Além de identificar vários genes modulados no linfoma de células do manto em nível celular, este estudo também revelou a expressão aberrante de diversos genes relacionados à apoptose e às vias de sinalização PI3K/AKT, WNT e TGFβ. Esses resultados adicionam informações originais à patogênese molecular do linfoma de células do manto e apontam para vias específicas de sinalização molecular como potenciais alvos para novas abordagens terapêuticas. / Mantle cell lymphoma is associated with the translocation t(11;14)(q13;32) and overexpression of cyclin D1. Mantle cell lymphoma is predominantly disseminated at diagnosis and a frank leukemic phase is detected in one third of patients. The pre-germinal-center naive B-cells, which populate the mantle zone of the secondary lymphoid follicles, are the cells of origin of mantle cell lymphoma. Overexpression of cyclin D1 is not sufficient by itself to cause lymphoma, and a better understanding of the additional molecular lesions may provide insights toward new therapeutic approaches. In this context, large scale gene expression studies may be useful in the investigation of such additional molecular lesions. However, the great majority of mantle cell lymphoma cases studied by these methods to date had the genetic material harvested from lymph nodes, which have a variable proportion of normal cells from the lymphoid stroma. It is therefore not known how many genes identified as differentially expressed in mantle cell lymphoma by tumor versus normal experiments are cell-autonomous rather than dependent on the tumor microenvironment. To address this issue, we compared the gene expression profile of mantle cell lymphoma cells and normal naive B-cells using oligonucleotide microarrays. Lymphoma cells and naive B-cells (IgD+CD38±CD27-) were highly purified, by magnetic activated cell sorting, from the peripheral blood of patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase and from tonsils of normal individuals, respectively (purity > 95% in all samples). Three individuals were selected for each group and experiments were performed in replicates using the Amersham CodeLink Human UniSet I Bioarrays, with 10,000 genes. We identified 106 genes differentially expressed with a fold change of at least three-fold, 63 induced and 43 repressed in mantle cell lymphoma in comparison with naive B-cells. Ten genes were selected (six induced and four repressed in lymphoma cells) for quantification by real-time RT-PCR in non-purified peripheral blood samples from 21 patients with mantle cell lymphoma in the leukemic phase, as well as in 14 patients with other chronic lymphoproliferative diseases and seven normal individuals. Microarray results were confirmed by real-time RT-PCR for all selected genes and expression values of the TLR1 gene as quantified by this method showed significant correlation with patient survival in mantle cell lymphoma. In addition to the identification of several modulated genes in mantle cell lymphoma at cellular level, this study revealed that some genes functionally connected through apoptosis or the PI3K/AKT, WNT and TGFβ signaling pathways are aberrantly expressed in mantle cell lymphoma. These results add original data to the molecular pathogenesis of mantle cell lymphoma and point to specific molecular signaling pathways related to inhibition of apoptosis as potential targets for new therapeutic approaches.

Die Zellen des Hodgkin-Lymphoms sind, neben einer permanenten Aktivierung des NF-kB Signalweges, durch eine konstitutive AP-1 Aktivität gekennzeichnet. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Analyse der aberranten AP-1 Aktivität in Zellen des Hodgkin-Lymphoms. Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang der JUN Promotor, da c-Jun unter anderem die Fähigkeit besitzt seinen eigenen Promotor positiv zu regulieren (Autoregulation). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Faktoren, die mit dem JUN Promotor in Zellen des Hodgkin-Lymphoms assoziiert sind, über verschiedene chromatographische Reinigungsschritte angereichert, mittels Massenspektrometrie identifiziert und hinsichtlich ihres Einflusses auf die c-Jun Expression analysiert. Dabei wurden die zwei Faktoren ATF-3, aus der Familie der AP-1 Proteine, und p52, aus der NF-kB Familie, hinsichtlich ihres Einflusses auf die Überexpression von c-Jun in Hodgkinzellen genauer untersucht. Die hier aufgeführten Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Regulation der konstitutiven AP-1 Aktivität in den Hodgkinzellen bei. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei Faktoren identifiziert werden, die maßgeblich an der Regulation der Expression von c-Jun in Hodgkinzellen beteiligt sind. Eine besondere Rolle kommt dabei dem Transkriptionsfaktor p52 zu, da dieser unter anderem auch die Expression anderer Mitglieder der AP-1 Familie reguliert. Ein weiterer Befund dieser Arbeit, dass p50 und p52 die zentralen Komponenten der konstitutiven NF-kB Aktivität sind, rückt p52 in das Zentrum zukünftiger Forschung. Die Befunde dieser Arbeit belegen, dass die aberrante Aktivierung von AP-1 im Hodgkin-Lymphom nicht auf ein einzelnes Ereignis in der Zelle zurückzuführen ist, sondern das Ergebnis eines komplexen Zusammenspiels vieler Faktoren ist. / The cells of Hodgkin''s lymphoma are characterized by a permanent activation of the NF-kB signaling pathway and a constitutive AP-1 activation. The present study focused on the analysis of aberrant AP-1 activity in cells of Hodgkin''s lymphoma. Of particular interest in this context is the JUN promoter, since c-Jun has the ability to regulate its own promoter (autoregulation). In this work different JUN promoter associated factors were enriched through various chromatographic purification steps, identified by Mass spectrometry and analyzed in terms of its influence on the expression of c-Jun. The focus was on specific factors in cells of Hodgkin''s lymphoma. The two factors ATF-3 and p52, were analyzed in terms of their influence on the overexpression of c-Jun in cells of Hodgkin''s lymphoma. Another interesting finding of this study is, p50 and p52 are central components of the constitutive NF-kB activity. This puts p52 in the center of future research. The results presented here contribute to a better understanding of the regulation of the constitutive AP-1 activity in the Hodgkin cells. In this work two Factors (ATF3 and p52) could be identified, which are are involved in the regulation of the expression of c-Jun in Hodgkin cells. A special role is played by the transcription factor p52, which also regulates the expression of other members of the AP-1 family. The findings of this study also show that the aberrant activation of AP-1 in Hodgkin''s lymphoma is not due to a single event in the cell. It is rather a result of a complex interplay of many factors.

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