Le sélénium est reconnu comme un micronutriment important pour l'homme et les animaux. Plusieurs études ont montré qu'une supplementation en sélénium dans le régime alimentaire pourrait être bénéfique contre les cancers du foie, du colon, du pancréas et de la prostate. Le mécanisme anti-carcinogène du sélénium se produit au niveau systémique, cellulaire et nucléaire. Ces processus peuvent également impliquer le système immunitaire et ne doivent pas être interprétés par un seul mécanisme. Jusqu'à présent son mécanisme d'action est encore inconnu. L'objectif de cette étude était d'étudier l'effet des composés du sélénium, à faibles concentrations, sur la capacité de réparation de l'ADN dans les cellules du cancer de la prostate LNCaP (p53 compétentes). Ce travail est divisé en trois parties. La première partie du travail a été consacrée à étudier l'effet des deux composés du sélénium (SS et SM) sur les propriétés cytotoxiques et génotoxiques de différents stress oxydatifs et non oxydatifs. Les résultats ont montré qu'un prétraitement avec une faible dose en Se stimulait la synthèse des sélénoprotéines, et protègait contre la toxicité et les dommages oxydatifs à l'ADN induites par les UVA ou H2O2, mais pas par MMS ou UVC. La deuxième partie a été consacrée à l'influence de la supplementation en sélénium sur la capacité de réparation de l'ADN. Notre travail a clairement montré l'augmentation de l'efficacité d'excision de certaines glycosylases que n'est pas nécessairement corrélée à une augmentation de l'expression génique et /ou protéiques. Enfin, la troisième partie de notre travail a été dédiée à l'optimisation de la technique Host Cell Reactivation (HCR) qui nous a permis d'étudier la capacité de réparation de l'ADN in cellulo, afin de cibler les partenaires impliqués dans la voie de signalisation affectées par la supplémentation en sélénium. En conclusion, nous pourront penser que le mécanisme d'action du sélénium est représenté par un délicat équilibre entre l'activation et la répression de l'activité de certaines protéines qui induit des changements conformationnels plus ou moins directement impliqués dans la réparation de l'ADN et la progression de la croissance cellulaire. / Selenium was recognized as an important micronutrient for both humans and animals. Several studies showed that increased selenium in the diet might be beneficial against liver, colon, pancreas and prostate cancer. The anticarcinogenic actions of Se occur at the systemic, cellular and nuclear level. These actions may also involve the immune system and thus cannot be interpreted by a single mechanism. Until now its mechanisms of action are not well understood. The objective of this study was to investigate the effect of selenocompounds at low doses on DNA repair capacity in the p53-proficient LNCaP prostate cancer cells. This work is divided into three parts. The first part of the work was devoted to study the effect of two selenocompounds (SS and SM) on the cytotoxic and genotoxic properties of various oxidative and non oxidative stresses. The results showed that low doses of Se pre-treatment stimulates selenoprotein synthesis, protects against toxicity and oxidative DNA damage induced by UVA or H2O2 but not by MMS or UVC. The second part of our investigation was devoted to the influence of selenium supplementation on DNA repair capacity. Our work clearly showed an increase in excision efficiency of the glycosylases activity that was not necessarily correlated with an increase of gene expression and/or protein levels. Finally, the third part of our work was devoted to the optimization of Host Cell Reactivation assay (HCR) to study the DNA repair capacity in cellulo, in order to target the partners involved in the signalling pathway affected by selenium supplementation. In conclusion, we could image that the mechanism of action of selenium is represented by a delicate balance between activation and repression of protein activity that induces conformational changes of several proteins more or less directly involved in DNA repair and progression of cell growth.

Host cell reactivation (HCR) of viruses has been used in the past to assess the DNA repair capacities of various mammalian cell types. In this study, a PCR-based HCR technique was developed for determining DNA repair capacity of mammalian cells. Many DNA lesions, including UV photoproducts, block DNA amplification by Taq polymerase, and the exponential nature of PCR imparts a tremendous potential for quantifying the remaining non-adducted DNA templates from small samples. Ad5HCMVspl ZacZ is a recombinant nonreplicating adenovirus (Ad) containing the lacZ reporter gene under the control of the human cytomegalovirus (HCMV) immediate early promoter inserted into the deleted El region of the viral genome. This virus is unable to replicate, but it can efficiently express the reporter gene in many types of mammalian cells, including human fibroblasts. Using quantitative PCR, the induction and repair of UV photoproducts was measured in a 2.6 kb region of the lacZ reporter gene inserted into the deleted El region of Ad5HCMVspllacZ and in a 2.8 kb region of the endogenous E4 region of the virus. Primers flanking the regions were added to equal amounts of DNA extracted from cells infected with unirradiated or UV-irradiated Ad5HCMVspl lacZ and each sample was amplified by PCR using radiolabelled nucleotides as substrates. PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and quantified using a phosphorimaging system. Results show a simple exponential decrease in PCR product with increasing UV fluence to the virus. There was a significant removal of UV photoproducts by 24 hours after infection of normal human fibroblasts. A reduced capacity for lesion removal was detected after infection of nucleotide excision repair deficient fibroblasts derived from patients with xeroderma pigmentosum (XP) and Cockayne syndrome (CS). Previous work from our lab using a P-gal reporter gene assay has shown that both UV light and heat shock treatment of cells prior to infection with UV-damaged Ad5HCMVspl lacZ enhances HCR. Application of the quantitative PCR technique to the study of inducible repair shows there is an enhancement in the rate of lesion removal from both regions of the vector in UV-irradiated normal lung fibroblast cells, compared to unirradiated cells. This demonstrates that previous reports of enhanced host cell reactivation are indicative of a genuine enhancement of DNA repair. Also, the P-gal reporter gene assay was used to investigate inducibility of UV lesion repair by ionising radiation; no significant increase in HCR of p-gal activity was found in cells treated with y-rays compared to untreated cells. / Thesis / Master of Science (MS)

Le sélénium est reconnu comme un micronutriment important pour l'homme et les animaux. Plusieurs études ont montré qu'une supplementation en sélénium dans le régime alimentaire pourrait être bénéfique contre les cancers du foie, du colon, du pancréas et de la prostate. Le mécanisme anti-carcinogène du sélénium se produit au niveau systémique, cellulaire et nucléaire. Ces processus peuvent également impliquer le système immunitaire et ne doivent pas être interprétés par un seul mécanisme. Jusqu'à présent son mécanisme d'action est encore inconnu. L'objectif de cette étude était d'étudier l'effet des composés du sélénium, à faibles concentrations, sur la capacité de réparation de l'ADN dans les cellules du cancer de la prostate LNCaP (p53 compétentes). Ce travail est divisé en trois parties. La première partie du travail a été consacrée à étudier l'effet des deux composés du sélénium (SS et SM) sur les propriétés cytotoxiques et génotoxiques de différents stress oxydatifs et non oxydatifs. Les résultats ont montré qu'un prétraitement avec une faible dose en Se stimulait la synthèse des sélénoprotéines, et protègait contre la toxicité et les dommages oxydatifs à l'ADN induites par les UVA ou H2O2, mais pas par MMS ou UVC. La deuxième partie a été consacrée à l'influence de la supplementation en sélénium sur la capacité de réparation de l'ADN. Notre travail a clairement montré l'augmentation de l'efficacité d'excision de certaines glycosylases que n'est pas nécessairement corrélée à une augmentation de l'expression génique et /ou protéiques. Enfin, la troisième partie de notre travail a été dédiée à l'optimisation de la technique Host Cell Reactivation (HCR) qui nous a permis d'étudier la capacité de réparation de l'ADN in cellulo, afin de cibler les partenaires impliqués dans la voie de signalisation affectées par la supplémentation en sélénium. En conclusion, nous pourront penser que le mécanisme d'action du sélénium est représenté par un délicat équilibre entre l'activation et la répression de l'activité de certaines protéines qui induit des changements conformationnels plus ou moins directement impliqués dans la réparation de l'ADN et la progression de la croissance cellulaire.

<p>Ageing is associated with a progressive decline in cognitive and physical function, as well as neurodegeneration. The DNA damage theory of ageing postulates that phenotypes associated with chronological ageing result from a time dependent accumulation of DNA damage caused by endogenously generated reactive oxygen species (ROS). In this work, we have used a host cell reactivation (HCR) technique to examine base excision repair (BER), the major pathway for removal of ROS generated damage, in fibroblasts from normal individuals and from patients with Cockayne syndrome (CS). The HCR assay utilizes an adenovirus encoded β-galactosidase (β-gal) reporter gene treated with methylene blue plus visible light (MB+VL) to measure BER of 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). The results presented here demonstrate that host cell repair mechanisms remove MB+VL generated 8-oxoG from viral DNA and that reactivation of gene expression correlates with cellular repair capacity and requires CSA and CSB. Using the HCR assay, we demonstrate that culturing of primary human fibroblasts in media containing low levels of MB increases BER, suggesting increased DNA repair capacity may play a role in the therapeutic application of MB in Alzheimer’s disease treatment. We also demonstrate that BER decreases <em>in vitro </em>with increasing number of cell divisions, and that HCR of the damaged reporter gene is lower in fibroblasts from older donors. Using a second β-gal reporter gene assay, the enhanced expression assay, we were unable to show a relationship between the degree of decreased BER in CS and severity of clinical phenotype. However, we identified an interaction between CSB and the telomere protein TRF2. Overexpression of TRF2 leads to decreased nucleotide excision repair of UVC induced damage in a CSB dependent manner. We also demonstrate defective telomeres in the absence of functional CSB. The data presented in this work provide additional support for the DNA damage theory of ageing.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)