La surexpression rétrovirale du facteur de transcription HOXB4 résulte en une expansion sélective des cellules souches hématopoïétiques (CSH) in vitro et in vivo et ce, sans induire de leucémie. Par contre, la demi-vie intracellulaire de la protéine est de seulement une heure et le fait que la protéine disparaît du milieu de culture après environ 4 heures représente un obstacle majeur à l’utilisation clinique de la protéine HOXB4. Trois mutants HOXB4 ayant une substitution d`un seul acides aminés (AA) parmi les 31 premiers AA ont démontré une augmentation de la stabilité de la protéine. Nous avons donc évalué l’effet de HOXB4 et de ses trois mutants sur la production de cellules progénitrices myéloïdes. L’expression ectopique de HOXB4 sauvage (s-HOXB4) et HOXB4 mutant (m-HOXB4) a un effet comparable sur la fréquence des cellules progénitrices myéloïdes en essai clonogénique. Par contre, la capacité de prolifération des cellules progénitrices myéloïdes qui surexpriment s-HOXB4 et 1423 m-HOXB4 a été supérieure à celle des cellules contrôles (GFP seul) et des deux autres mutants. De plus, malgré le fait que toutes les variantes de HOXB4 confèrent une capacité d’autorenouvellement similaire aux cellules progénitrices multipotents (GEMM), la production des progéniteurs granulocytaires (CFU-G) est compromise lorsque les cellules surexpriment 1426 et 1427 m-HOXB4. D’autre part, la densité cellulaire des colonies myéloïdes qui surexpriment ces deux mutants est diminuée, ce qui suggère que ces mutations ont non seulement augmenté sa stabilité, mais potentiellement affecté certaines fonctions biologiques de s-HOXB4. Enfin, 1423 m-HOXB4 semble n’avoir perdu aucune fonction de s-HOXB4 dans nos évaluations clonogéniques in vitro, ce qui fait de ce mutant une molécule intéressante pour des applications cliniques d’expansion des cellules progénitrices hématopoïétiques. / Over-expression of the homeobox transcription factor HOXB4 results in a selective expansion of HSC in vitro and in vivo. However, the intracellular half-life of the protein is only one hour, which represents an important obstacle for its clinical use. Three HOXB4 mutants with single amino acid (AA) substitution in the first 31 AA have demonstrated increased intracellular stability of the protein. We evaluated the effect of wild type (wt) and mutant (m) HOXB4 on expansion and differentiation of myeloid progenitors. Ectopic expressions of wt- and m- HOXB4 had a comparable effect on the frequency of myeloid progenitors in semi-solid assay. However, the proliferative capacity of myeloid progenitors expressing wt-HOXB4 and 1423 m-HOXB4 was considerably better than that of control (GFP only) and other two mutants. Additionally, while all HOXB4 variants conferred similar self-renewal capacity to multipotent (GEMM) progenitors, the production of single-lineage granulocytic progenitors (CFU-G) was severely compromised when cells were expressing 1426 and 1427 m-HOXB4. Conversely, the cellularity of myeloid colonies was also diminished with these mutants suggesting, that both mutations affect certain biologic function(s) of wt-HOX4 in addition to increasing its stability. On the other hand, 1423 m-HOXB4 did not seem to lose any wt-HOXB4 functions tested in in vitro assays making this mutant an interesting target for further investigation.

La surexpression rétrovirale du facteur de transcription HOXB4 résulte en une expansion sélective des cellules souches hématopoïétiques (CSH) in vitro et in vivo et ce, sans induire de leucémie. Par contre, la demi-vie intracellulaire de la protéine est de seulement une heure et le fait que la protéine disparaît du milieu de culture après environ 4 heures représente un obstacle majeur à l’utilisation clinique de la protéine HOXB4. Trois mutants HOXB4 ayant une substitution d`un seul acides aminés (AA) parmi les 31 premiers AA ont démontré une augmentation de la stabilité de la protéine. Nous avons donc évalué l’effet de HOXB4 et de ses trois mutants sur la production de cellules progénitrices myéloïdes. L’expression ectopique de HOXB4 sauvage (s-HOXB4) et HOXB4 mutant (m-HOXB4) a un effet comparable sur la fréquence des cellules progénitrices myéloïdes en essai clonogénique. Par contre, la capacité de prolifération des cellules progénitrices myéloïdes qui surexpriment s-HOXB4 et 1423 m-HOXB4 a été supérieure à celle des cellules contrôles (GFP seul) et des deux autres mutants. De plus, malgré le fait que toutes les variantes de HOXB4 confèrent une capacité d’autorenouvellement similaire aux cellules progénitrices multipotents (GEMM), la production des progéniteurs granulocytaires (CFU-G) est compromise lorsque les cellules surexpriment 1426 et 1427 m-HOXB4. D’autre part, la densité cellulaire des colonies myéloïdes qui surexpriment ces deux mutants est diminuée, ce qui suggère que ces mutations ont non seulement augmenté sa stabilité, mais potentiellement affecté certaines fonctions biologiques de s-HOXB4. Enfin, 1423 m-HOXB4 semble n’avoir perdu aucune fonction de s-HOXB4 dans nos évaluations clonogéniques in vitro, ce qui fait de ce mutant une molécule intéressante pour des applications cliniques d’expansion des cellules progénitrices hématopoïétiques. / Over-expression of the homeobox transcription factor HOXB4 results in a selective expansion of HSC in vitro and in vivo. However, the intracellular half-life of the protein is only one hour, which represents an important obstacle for its clinical use. Three HOXB4 mutants with single amino acid (AA) substitution in the first 31 AA have demonstrated increased intracellular stability of the protein. We evaluated the effect of wild type (wt) and mutant (m) HOXB4 on expansion and differentiation of myeloid progenitors. Ectopic expressions of wt- and m- HOXB4 had a comparable effect on the frequency of myeloid progenitors in semi-solid assay. However, the proliferative capacity of myeloid progenitors expressing wt-HOXB4 and 1423 m-HOXB4 was considerably better than that of control (GFP only) and other two mutants. Additionally, while all HOXB4 variants conferred similar self-renewal capacity to multipotent (GEMM) progenitors, the production of single-lineage granulocytic progenitors (CFU-G) was severely compromised when cells were expressing 1426 and 1427 m-HOXB4. Conversely, the cellularity of myeloid colonies was also diminished with these mutants suggesting, that both mutations affect certain biologic function(s) of wt-HOX4 in addition to increasing its stability. On the other hand, 1423 m-HOXB4 did not seem to lose any wt-HOXB4 functions tested in in vitro assays making this mutant an interesting target for further investigation.

Yes / Background The HOX genes are a family of homeodomain-containing transcription factors that determine cellular identity during development and which are dys-regulated in some cancers. In this study we examined the expression and oncogenic function of HOX genes in mesothelioma, a cancer arising from the pleura or peritoneum which is associated with exposure to asbestos. Methods We tested the sensitivity of the mesothelioma-derived lines MSTO-211H, NCI-H28, NCI-H2052, and NCI-H226 to HXR9, a peptide antagonist of HOX protein binding to its PBX co-factor. Apoptosis was measured using a FACS-based assay with Annexin, and HOX gene expression profiles were established using RT-QPCR on RNA extracted from cell lines and primary mesotheliomas. The in vivo efficacy of HXR9 was tested in a mouse MSTO-211H flank tumor xenograft model. Results We show that HOX genes are significantly dysregulated in malignant mesothelioma. Targeting HOX genes with HXR9 caused apoptotic cell death in all of the mesothelioma-derived cell lines, and prevented the growth of mesothelioma tumors in a mouse xenograft model. Furthermore, the sensitivity of these lines to HXR9 correlated with the relative expression of HOX genes that have either an oncogenic or tumor suppressive function in cancer. The analysis of HOX expression in primary mesothelioma tumors indicated that these cells could also be sensitive to the disruption of HOX activity by HXR9, and that the expression of HOXB4 is strongly associated with overall survival. Conclusion HOX genes are a potential therapeutic target in mesothelioma, and HOXB4 expression correlates with overall survival. / The authors gratefully acknowledge the support of the British Lung Foundation, grant number ICAPPG10-1. KJH acknowledges support from the ICR/RM NIHR Biomedical Research Centre.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The E2A-PBX1 fusion gene results from the t(1;19) chromosomal translocation that is found in 25% of pre-B-cell cases of acute lymphoblastic leukemia (ALL). The resulting encoded product contains the transactivation domains of E2A, a Class I basic helix-loop-helix transcription factor, and most of PBX1. PBX1 is a major cofactor for most members of the HOX family of homeodomain proteins and is necessary for regulating the essential role that HOX proteins play in development and tissue homeostasis. We have identified an interaction between the E2A-encoded portion of E2A-PBX1 and the CREB-binding domain (KIX) of the transcriptional coactivator CBP and demonstrated a requirement for this interaction in leukemia induction. Others have shown that HOX proteins and CBP also interact directly, with resulting inhibitory effects on the DNA-binding ability of HOX proteins and on the acetylation of substrate proteins by CBP. Several publications have also identified the interaction of HOX proteins with the PBX1 portion of E2A-PBX1 and the result is a potent transcriptional activator at PBX1/HOX target sequences. In an attempt to develop a molecular model for the induction of ALL by E2A-PBX1, we hypothesize that the addition of CBP interactive peptide elements encoded by E2A to PBX1 allows E2A-PBX1 to stabilize a ternary complex involving E2A-PBX1, HOX, and CBP resulting in the deregulated expression of critical PBX1 or HOX target genes. I demonstrate using in vitro protein-protein interactions that this ternary complex involving E2A-PBX1, HOXB4 (chosen as a representative member of the HOX family), and CBP does form. This direct interaction appears to reduce transcriptional activation by E2A-PBX1/HOXB4 heterodimers from PBX1/HOX enhancer elements. I also show that this suppression of transactivation appears to involve CBP antagonism of DNA binding by E2A-PBX1/HOXB4 heterodimers. My results are consistent with the idea that E2A-PBX1 contributes to ALL induction by promoting the redistribution of CBP away from DNA sites bound by E2A-PBX1/HOXB4 heterodimers and in favour of those sites bound by E2A-PBX1 homodimers. / Thesis (Master, Pathology & Molecular Medicine) -- Queen's University, 2008-09-29 13:57:25.324

Attempts for the in vitro differentiation of reconstituting human HSCs from ESCs have been unsuccessful as key factors of HSC specification remain unclear. Enforced HOXB4 expression can enhance haemopoietic differentiation of mouse and human ESCs and generate reconstituting HSCs from mouse ESCs. We have previously shown that HOXB4 can enhance haemopoietic differentiation of mouse ESCs in a paracrine manner. Microarray analysis identified a number of secreted factors upregulated by HOXB4 potentially mediating this paracrine effect. The aim of this study was to assess whether these factors alone and/or in combination can enhance the in vitro haemopoietic differentiation of mouse and human ESCs. We first developed a defined, serum and feeder-free protocol to test the effects of these secreted factors on haemopoietic differentiation. This defined protocol allowed us to compare the haemopoietic potential of mouse ESCs with the recently derived epiblast stem cells (EpiSCs), thought to be comparable to hESCs. Haemopoietic colony forming assay and flow cytometry analysis showed that serum-free conditions generated 8- 10 fold more CD144+CD41+ and c-Kit+CD41+ haemopoietic progenitor cells (HPCs) compared to serum conditions from both ESCs and EpiSCs, with ESCs giving the most significant increase. We then validated the panel of HOXB4 target genes by QRT-PCR and selected those increased in expression by at least 2.5-fold when HOXB4 was activated. We used this defined, serum-free protocol to assess the effects of our panel of secreted factors, FGF17, RSPO3 and APLN, on the haemopoietic differentiation of mouse ESCs. We demonstrated that FGF17 can mediate HOXB4 haemopoietic activity by enhancing the generation of c-Kit+ HPCs. On the other hand increasing concentrations of RSPO3 inhibited haemopoietic development by reducing the numbers of CD41+ and CD41+CD45+ HPCs, while, APLN did not have any effects on the haemopoietic activity of the cells. We finally used the secreted factors in human ESC and iPSC differentiation cultures. We observed differences in the activity of the tested factors not only between species but also between human cell lines. These results suggest that HOXB4 haemopoietic activity is partly mediated by paracrine signalling but more complex cell interactions are probably required for it to fully exert its effects. More importantly, HOXB4 regulatory pathways differ between mouse and human cells stressing the need for careful translation of data between the two species and more detailed analysis of key human haemopoietic factors for the successful generation of reconstituting HSCs.

Les cellules tueuses naturelles (NK pour Natural Killer) sont une population lymphoïde dotées d’une activité cytotoxique contre les cellules infectées ou les cellules cancéreuses. Les cellules NK ont un potentiel thérapeutique considérable en tant que thérapie cellulaire anti-tumorale, particulièrement dans le cadre des leucémies. Ces approches sont basées sur une amélioration de la production de cellules NK à partir de cellules souches hématopoïétiques (quantitative et qualitative en améliorant leur activité lytique), mais aussi sur une manipulation de la sensibilité des cellules leucémiques à la lyse par les cellules NK. L’amélioration de ces approches nécessite une compréhension plus approfondie des différents mécanismes de résistance leucémique et leur relation avec la sensibilité à la lyse. Dans ce contexte, nous avons étudié le rôle de HOXB4 dans la différenciation des cellules NK et leur fonction lytique. Nous avons montré que les cellules CD34+ différenciées en cellules NK en présence de HOXB4 ont un potentiel lytique plus important par rapport aux cellules différenciées en l’absence de HIOXB4. Cette augmentation est associée à une augmentation de la dégranulation des cellules NK en présence de cellules cibles. L’analyse transcriptionnelle globale basé sur un microréseau d'ADN montre une régulation positive de l’expression de granzyme B par HOXB4. Ces résultats démontrent que HOXB4 est un régulateur crucial dans la différenciation et la fonction des cellules NK. Ils soulignent également l’intérêt de son utilisation dans la production de cellules NK fonctionnelles dotées d’un plus grand potentiel lytique pour les stratégies d'immunothérapie anticancéreuse. Nous avons également essayé de comprendre comment l'acquisition de la résistance aux chimiothérapies par les cellules de leucémie aigüe myéloïde (LAM) influence leur reconnaissance et leur sensibilité aux cellules NK. Nous avons montré que l'acquisition de la résistance in vitro des cellules AML à la cytarabine induit une augmentation de leur susceptibilité à la cytotoxicité dépendante des cellules NK. Cette sensibilité accrue est en corrélation avec l’induction d’ULBP (UL-16 binding proteins) 1/2/3, ligands des récepteurs NKG2D, sur les cellules leucémiques résistantes. Cette induction est régulée par un mécanisme impliquant l'induction de c-Myc. Le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a révélé qu’ULBP1 et ULBP3 sont des cibles directes de c-Myc. L’utilisation de cellules AML primaires résistants à la chimiothérapie comme les cellules cibles, combinée à l'inhibition de c-Myc a entraîné une diminution de l'expression des ligands NKG2D et l'altération de la lyse par les cellules NK. Les propriétés d’alloréactivité des cellules NK pourraient être utilisées pour améliorer les résultats de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques chez les patients atteints d’AML. Cependant, la résistance croisée (chimiothérapie et NK) des blastes AML reste un problème majeur. Nous avons étudié la relation entre résistance des cellules leucémiques à la daunorubicine, la susceptibilité de ces cellules à la lyse par les cellules NK et l'expression putative des micro-RNAs. Nos résultats indiquent que l'acquisition de la résistance à la daunorubicine par les lignées de cellules parentales induit une résistance croisée à la cytotoxicité naturelle à médiation cellulaire. L'analyse des microréseaux de microRNAs a révélé que cette résistance croisée est associée à une diminution du miR-181a et une augmentation des gènes de la famille tyrosine kinase (MAP3K10 et MAP2K1) et de la famille Bcl-2 (Bcl-2 et Mcl-1). La surexpression de miR-181a dans les blastes AML entraîne l'atténuation de leur résistance à la daunorobucine et à la lyse par les cellules NK. / Natural Killer (NK) cells are a lymphoid population with potent cytotoxic activity against virus-infected or cancer cells, and which hold considerable potential for cell based therapies targeting human malignancies. Potential approaches include not only enhancing the generation of NK cells in number and improving their lytic activity, but also manipulating the susceptibility of blast cells to NK-mediated killing. Pursuing these approaches will require a more thorough understanding of the different mechanisms of resistance and their relationship with susceptibility to NK-mediated killing. In this context, we studied the role of HOXB4 in NK cells differentiation and lytic function. We showed that HOXB4 transduced MS-5 cells as compared with GFP-transduced MS-5 cells induced highly differentiated cytotoxic NK cells. This difference was associated with an increased induction of granzyme B degranulation in response to stimulation with NK cell susceptible targets. DNA microarray-based global transcriptional profiling confirmed the upregulation of granzyme B. These findings provide further evidence that HOXB4 is a crucial regulator of NK function and that its use in generating functional NK cells with increased lytic potential may be significant for cancer immunotherapy. We attempted to elucidate how acquisition of drug resistance in AML cells influences NK cell recognition and the killing of drug-resistant blasts. We showed that the in vitro acquisition of AML cell resistance to cytarabine resulted in an increase in their susceptibility to NK-mediated cell cytotoxicity. The increased susceptibility correlates with the induction of UL-16 binding proteins (ULBP) 1/2/3 and NK group 2, member (NKG2D) ligands on target cells by a mechanism involving c-Myc induction. More importantly, chromatin immunoprecipitation assay revealed that ULBP1/3 are direct targets of c-Myc. Using drug resistant primary AML blasts as target cells, inhibition of c-Myc resulted in decreased expression of NKG2D ligands and the subsequent impairment of NK cell lysis. This study provides for the first time, the c-Myc dependent regulation of NKG2D ligands in AML. Manipulating NK-cell alloreactivity might improve outcomes after hematopoietic stem-cell transplantation; however, cross-resistance among blasts remains a drawback. We attempted to investigate the relationship between AML to daunorubicin, the susceptibility to NK cellmediated cell lysis and the putative expression of miRs. Our results indicate that the acquisition of resistance to daunorubicin by the parental cell lines resulted in the acquisition of a cross-resistance to natural cell-mediated cytotoxicity. miR microarray analysis revealed that this cross-resistance was associated with miR-181a down regulation and the subsequent regulation of the tyrosine kinase (MAP3K10 and MAP2K1) and the BCL-2 (BCL-2 andMCL-1) families. Overexpression of miR-181a in AML blasts resulted in the attenuation of their resistance to daunorobucin and to NK-cell-mediated killing.

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique. / Ex vivo hematopoietic stem cell expansion represents a most appealing option to improve bone marrow transplantation. Utilization of the unique hematopoietic stem cell (HSC) expansion abilities of the transcription factor HOXB4 for clinical applications is hampered by its short intracellular half-life. To overcome this difficulty, 3 different single amino-acid substitution mutants of HOXB4 with 3-4 fold increased half-life were generated and their biologic activity compared to that of wild type (wt) HOXB4 using in vitro and in vivo assays. We have shown that overexpression of mutated HOXB4 in HSC using an infection strategy did not impair their long term hematopoietic reconstitution potential in transplanted mice. We have found that cells overexpressing mutant HOXB4 had greater expansion in vitro in competitive and non-competitive designs than wt HOXB4. Moreover, in vivo peripheral blood and spleen repopulation had lymphoid and myeloid contributions closer to untransplanted animals with mutant than wt HOXB4. In addition, cells overexpressing mutant HOXB4 protein were detected much more rapidly and in greater proportion in peripheral blood than cells overexpressing the wt form. One of the mutated HOXB4 proteins (1426) did not promote the expansion of common myeloid progenitors in comparison to wt HOXB4. Finally, using intracellular protein modulation studies, we have shown that the effects of mutated and wt HOXB4 proteins in hematopoietic stem and progenitor cells were not completely due to a HOXB4 concentration effect.

La greffe de cellules souches hématopoïétiques autologue est une thérapie de plus en plus utilisée. Cependant, les traitements de chimiothérapie ou de radiothérapie intensifs peuvent affecter les cellules souches et diminuer le nombre de ces cellules pouvant être mobilisées à des fins de transplantation. Il serait donc très utile de pouvoir expandre ces cellules souches afin de s’assurer qu’elles soient en quantité suffisante pour procéder à la greffe. Or, il a été démontré que la protéine HOXB4 a la capacité d’expandre les cellules souches hématopoïétiques humaines et murines. Lors d’une greffe autologue, la moelle osseuse est cependant colonisée par des cellules malignes. Notre objectif était donc de s’assurer que la protéine HOXB4 expand les cellules souches hématopoïétiques normales mais n’expand pas les cellules « souches » leucémiques. De plus, comme des expériences précédentes ont démontré que chez des souris transplantées avec des cellules souches surexprimant HOXB4, la reconstitution du système hématopoïétique pouvait favoriser les cellules myéloïdes aux dépends des cellules lymphoïdes, nous avons aussi voulu déterminer l’impact de HOXB4 sur la différenciation des cellules progénitrices lymphoïdes normales. Pour ce faire, nous avons exposé des cellules humaines et murines à la protéine HOXB4 afin de comparer la prolifération des cellules B malignes à celle des cellules B normales. De plus, nous avons évalué l’impact de HOXB4 sur les cellules B à leurs différents stades de différenciation. Nos résultats démontrent que HOXB4 ne favorise pas l’expansion des cellules leucémiques. De plus, nous avons observé que les cellules lymphoïdes surexprimant la protéine HOXB4 ont un ralentissement dans leur processus de différenciation. Aussi, la surexpression de HOXB4 entraîne une diminution de la fréquence et du nombre de progéniteurs lymphoïdes normaux. Ces résultats démontrent donc que la protéine HOXB4 ne produit pas d’expansion des cellules malignes. De plus, elle confère un désavantage prolifératif aux cellules lymphoïdes. / Transplantation of autologous hematopoietic stem cell is increasingly used. However, intensive chemotherapy or radiation therapy protocols can affect stem cells and decrease the number of these cells that can be mobilized for stem cell transplantation. There is therefore a need to create protocols for the expansion of these stem cells to increase their numbers sufficiently to proceed to transplantation. It has been demonstrated that the protein HOXB4 has the ability to expand human and murine hematopoietic stem cells. In the context of autologous transplantation, the bone marrow is often colonized by malignant cells. Our objective was to ensure that the protein HOXB4 expands normal hematopoietic stem cells but not leukemia "stem" cells. In addition, since previous experiments have shown that in mice transplanted with stem cells overexpressing HOXB4, hematopoietic reconstitution could favour myeloid cells over lymphoid cells, we determined the impact of HOXB4 on the differentiation of normal lymphoid progenitor cells. Toward this goal, we have exposed human and mouse leukemia cells to HOXB4 and compared the proliferation of malignant versus normal B cells. In addition, we have evaluated the impact of HOXB4 on the different stages of B cell differentiation. Our results show that HOXB4 does not favour leukemia cell expansion. In addition, we observed that lymphoid cells overexpressing HOXB4 are slowed in their differentiation process. Also, HOXB4 overexpression decreases the frequency and number of normal lymphoid progenitors. These results demonstrate that HOXB4 protein does not lead to malignant stem cell expansion. In addition, the HOXB4 protein confers a proliferative disadvantage to lymphoid cells.

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des outils puissants pour explorer la genèse des différents tissus de l’organisme, notamment le tissu hématopoïétique. Dans le but d’obtenir des types cellulaires cliniquement utiles, la majorité des travaux se sont concentrés sur l’obtention des cellules hématopoïétiques terminales, notamment des cellules lymphoïdes (lymphocytes B, lymphocyte T et cellules NK), à partir des cellules souches pluripotentes humaines. En revanche, le rendement des cellules hématopoïétiques obtenues dans ce modèle reste faible. D’autre part, les étapes précoces de l’hématopoïèse, notamment l’identification de la cellule souche hématopoïétique (CSH), des progéniteurs myéloïdes et lymphoïdes à partir des cellules souches pluripotentes, sont encore très peu définies. Nous nous sommes intéressés aux étapes précoces de la lymphopoïèse dans le modèle des CSEh. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de l’homéoprotéine HOXB4 dans l’expansion des progéniteurs NK dérivés des CSEh. Nous avons montré que l’exposition des cellules des corps embryonnaires (EB pour Embryoid Body), dérivées de la différenciation des CSEh, à la lignée MS-5/SP-HOXB4, une lignée modifiée qui exprime constitutivement HOXB4, induit une expansion des progéniteurs NK dérivées des CSEh. De plus, les cellules NK qui en dérivent sont matures et fonctionnelles, de part leur activité cytolytique vis-à-vis d’une lignée érythro-leucémique (K562). Outre l’effet de HOXB4 sur l’expansion des progéniteurs NK, cette étude a permis de démontrer en particulier le rôle de la lignée stromale MS-5 dans l’induction de la spécification lymphoïde à partir des CSEh. Dans un deuxième temps, nous avons analysé plus précisément les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine à partir des CSEh. En effet, nous avons montré, au cours de la première partie, que la coculture des cellules dérivées des EB avec MS-5 induit l’expression en surface du CD45RA, un marqueur de spécification lymphoïde, au sein des progéniteurs hématopoïétiques CD34+. Ainsi, sur la base de ces données et des données antérieurs concernant les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine fœtale et adulte, nous avons identifié et caractérisé in vitro à partir des CSEh deux populations originales de progéniteurs lymphoïdes précoces multipotents (MELP pour Myeloid Early Lymphoid Progenitor): La progéniteur CD34+CD45RA+CD7+ dont le potentiel de différenciation est biaisé vers le lignage T et NK ; et le progéniteur CD34+CD45RA+CD7- a un potentiel de différenciation biaisé vers les lymphocytes B. Cette étude a un intérêt dans la compréhension du processus de la lymphopoïèse humaine dans le modèle des cellules souches pluripotentes. En perspective, ces données pourraient avoir également un intérêt dans la modélisation de maladie de défauts génétiques de développement du système lymphoïde. / Human embryonic stem cells (hESC) are powerful tools to explore tissue genesis of the organism, especially hematopoietic tissue. In order to obtain cellular types clinically useful, the majority of works have been focalised on final output of hematopoietic cells, especially lymphoid cells (lymphocyte B, lymphocyte T and NK cells), from human pluripotent stem cells. However, the obtained hematopoietic cells yield is very poor. In the other hand, initial steps of hematopoiesis, especially the identification of the hematopoietic stem cell, myeloid and lymphoid progenitors, from pluripotent stem cells, are poorly defined. We were interested to early steps of lymphopoisis in the hESC model. Initially, we studied the role of HOXB4 homeprotein on CSEh-derived NK progenitor. We showed that exposure of embryoid body (EB), derived from hESC, to the modified line that express constitutively HOXB4 “MS-5/SP-HOXB4”, induce hESC-derived NK progenitor expansion. Furthermore, the derived NK cells are mature and fonctionnal, by cytolytic activity on erythro-leucemic line K562. Furthermore the effect of HOXB4 on NK progenitor expansion, this study demonstrated, particularly the role of MS-5 line on the lymphoid specification from hESC.Secondly, we analysed more precisely the early steps of human lymphopoiesis from hESC. We showed, in the first part, that MS-5 coculture of the EB-derived cells induce surface expression of CD45RA (marker of lymphoid specification) on hematopoietic progenitor CD34+. Thus, on the basis of these data and previous data concerning the initial steps of fetal and adult lymphopoiesis, we identified and characterized in vitro from hESC, two populations of multipotent early lymphoid progenitor (MELP): the CD34+CD45RA+CD7+ progenitor whose the differentiation potential is biased to T and NK lineage, and the CD34+CD45RA+CD7- progenitor has differentiation potential biased to B lineage. This study is essential in understanding of normal and pathological lymphopoisis process in pluripotent stem cells model. Additionally, this study paves the way for the modeling of genetic disorders of lymphoid system.