Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Notre équipe s’intéresse à la différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) vers la lignée des lymphocytes T. Contrairement aux autres lignées sanguines, qui se développent dans la MO, les progéniteurs des lymphocytes T doivent terminer leur différenciation dans le thymus. Ma thèse a un double objectif: 1) caractériser les progéniteurs candidats à la reconstitution T pour établir leur contribution à celle-ci et 2) identifier les stades initiaux de la reconstitution T. Nous avons mis en évidence que seul le progéniteur multipotent au stade 3 (MPP3 : Lin- Sca1+ c-Kit+ VCAM1- Flt3+) et le progéniteur commun lymphoïde (CLP : Lin- Sca1lo c-Kitlo IL7Ra+ Flt3-) circulent dans le sang. De plus, nos résultats montrent que les gènes impliqués dans l’engagement T et dans la migration thymique sont uniquement exprimées par la population MPP3 circulante. Cette population est la plus compétente pour générer des précurseurs T (pré-T). Au contraire, les CLPs sont plus efficaces pour la production de différents types de cellules B de la rate. Par la suite, mon projet a consisté à déterminer la proportion de progéniteurs contribuant à la reconstitution T. En effet, le thymus peut être colonisé par différents progéniteurs (LMPP, Lymphoid-primed Multipotent Progenitors, et CLP), mais leur contribution dans la différenciation T reste inconnue et est sujet à controverse. Nous avons utilisé une stratégie innovante pour suivre les progéniteurs avec une séquence d’ADN ou Code Barre (CB) intégrée dans le génome par un vecteur viral. Les résultats préliminaires indiquent qu'une forte fréquence de CBs en provenance de la population LMPP est retrouvée dans le compartiment T thymique. Dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à élucider le premier stade de différenciation T dans le thymus et l’identité cellulaire et moléculaire des premiers migrants thymiques pour comprendre le délai de génération de ce compartiment. La population thymique la plus immature (TN1 : Lin- CD44+ CD25+) présente différentes sous-population selon l’expression de c-Kit et de CD24 chacune de ces différentes populations TN1 pourrait participer à cette reconstitution T. Leur analyse moléculaire montre deux lignées cellulaire selon l’expression de Pu1, dans les TN1 c-Kit+, et de Cd3e, dans la sous-population TN1e (CD24- c-Kit-). En parallèle, pour éclaircir le processus d’engagement des cellules T, ces sous-populations de TN1 ont été étudiées dans différentes conditions de reconstitution : une reconstitution endogène suite à une irradiation sub-létale et une exogène après greffe de MO. Nos résultats permettent de préciser les caractéristiques, propres aux progéniteurs thymiques au stade TN1, qui leur confèrent des compétences à se différencier et à proliférer plus efficacement. Après irradiation ou greffe de MO, le compartiment TN1 est constitué de cellules à faible capacité proliférative. Le thymus en état de reconstitution génère tout d’abord des cellules présentatrice d’antigène (APC) puis les cellules T. Ces deux points suggèrent que les cellules à faible capacité proliférative seront plus aptes à générer des cellules APC plutôt que des cellules T. Il reste à déterminer quel environnement thymique permet le maintien des cellules à faible capacité proliférative, notamment, par rapport à l’expression de Delta-4, de l’IL7 et du ligand c-Kit. Cela va permettre l'identification de facteurs favorisant leur induction et leur expansion. Il nous semble aussi intéressant d’étudier la contribution de la population à faible capacité proliférative, TN1 CD24- c-Kit-, dans la différenciation T. / Within the hematopoietic system, hematopoietic stem cells (HSCs) are the only cells with the functional capacity to give rise to all blood lineages and to self-renew for life. These properties and the ability of HSCs to engraft conditioned recipients permitted to apply these cells in regenerative medicine. Like all blood lineages, T cells develop from bone marrow HSC. However, T lineage development requires many weeks, three separate anatomical sites (bone marrow, blood and thymus), many environments and the loss of multiple alternative lineage potentials. Many questions remain to be clarified during this process: do all progenitors have an intrinsic feature of T cell development ? How does this intrinsic potential express ? How the bloodstream contributes to the T cell development ? Which BM progenitor contributes to T cell reconstitution ? What are the characteristics of T cell reconstitution ? We have shown that only the multipotent progenitor in stage 3 (MPP3: Lin- Sca1+ c-Kit+ VCAM1- Flt3+) and a subset of the common lymphoid progenitor (CLP Flt3-: Lin- Sca1lo c-Kitlo IL7Ra+ Flt3-) circulate in the blood. Moreover, our results show that T cell engagement and thymic migration genes are modulated in the circulation, especially up-regulated in the MPP3 circulating subset. This population present a T cell intrinsic potential and is the most competent to generate precursors T (pre-T). On the contrary, CLPs subsets are more efficient for the production of different B cells. Lymphoid primed multipotent progenitor (LMPP, MPP Flt3+) and CLP subsets' respective contributions to the T cell pathway are still being hotly debated. Multiple progenitors in BM have been shown to possess T lineage potential when placed in the thymus. However, it is unlikely that all of them contribute physiologically to thymopoiesis. It was claimed that CLPs are the earliest lymphoid committed progenitor from which B and T lineage cells arise. However, the concept that the CLP is the progenitor population through which all T lymphocytes are derived has been challenged. More specifically, which BM progenitor contribute to the T cell reconstitution ? In order to answer this question, we used an innovative strategy to follow the progenitors with a DNA sequence or Barcode (BC) integrated into the genome by a viral vector. Preliminary results indicate that a high frequency of BCs from the LMPP population is found in the T cell lineage. Finally, we characterized the first stage of T cell differentiation in the thymus by a cellular and molecular asses. We show that the most immature thymic population (TN1: Lin- CD44+ CD25+), at the molecular level, contain two separate lineages, detected by Pu1 (TN1a and b) or CD3e (TN1e) gene expression. In order to clarify the process of T-cell involvement, these TN1 subsets have been studied under different reconstitution conditions: endogenous reconstruction following sub-lethal irradiation and exogenous after bone marrow (BM) graft. In these conditions, the TN1 compartment presents cells with low proliferative capacity and that antigen presenting cells (APC) are the first mature population and thus T cells are generated in second place. These two points suggest that cells with low proliferative capacity will be more apt to generate APC cells rather than T cells. It remains to be determined which thymic environment permits the maintenance of cells with a low proliferative capacity, in particular, with respect to the expression of Delta-4, IL7 and the c-Kit ligand. This will allow the identification of factors favoring their induction and their expansion. It also seems interesting to study the contribution of the population with low proliferative capacity, TN1 CD24- c-Kit-, in the T cell differentiation.

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des outils puissants pour explorer la genèse des différents tissus de l’organisme, notamment le tissu hématopoïétique. Dans le but d’obtenir des types cellulaires cliniquement utiles, la majorité des travaux se sont concentrés sur l’obtention des cellules hématopoïétiques terminales, notamment des cellules lymphoïdes (lymphocytes B, lymphocyte T et cellules NK), à partir des cellules souches pluripotentes humaines. En revanche, le rendement des cellules hématopoïétiques obtenues dans ce modèle reste faible. D’autre part, les étapes précoces de l’hématopoïèse, notamment l’identification de la cellule souche hématopoïétique (CSH), des progéniteurs myéloïdes et lymphoïdes à partir des cellules souches pluripotentes, sont encore très peu définies. Nous nous sommes intéressés aux étapes précoces de la lymphopoïèse dans le modèle des CSEh. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de l’homéoprotéine HOXB4 dans l’expansion des progéniteurs NK dérivés des CSEh. Nous avons montré que l’exposition des cellules des corps embryonnaires (EB pour Embryoid Body), dérivées de la différenciation des CSEh, à la lignée MS-5/SP-HOXB4, une lignée modifiée qui exprime constitutivement HOXB4, induit une expansion des progéniteurs NK dérivées des CSEh. De plus, les cellules NK qui en dérivent sont matures et fonctionnelles, de part leur activité cytolytique vis-à-vis d’une lignée érythro-leucémique (K562). Outre l’effet de HOXB4 sur l’expansion des progéniteurs NK, cette étude a permis de démontrer en particulier le rôle de la lignée stromale MS-5 dans l’induction de la spécification lymphoïde à partir des CSEh. Dans un deuxième temps, nous avons analysé plus précisément les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine à partir des CSEh. En effet, nous avons montré, au cours de la première partie, que la coculture des cellules dérivées des EB avec MS-5 induit l’expression en surface du CD45RA, un marqueur de spécification lymphoïde, au sein des progéniteurs hématopoïétiques CD34+. Ainsi, sur la base de ces données et des données antérieurs concernant les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine fœtale et adulte, nous avons identifié et caractérisé in vitro à partir des CSEh deux populations originales de progéniteurs lymphoïdes précoces multipotents (MELP pour Myeloid Early Lymphoid Progenitor): La progéniteur CD34+CD45RA+CD7+ dont le potentiel de différenciation est biaisé vers le lignage T et NK ; et le progéniteur CD34+CD45RA+CD7- a un potentiel de différenciation biaisé vers les lymphocytes B. Cette étude a un intérêt dans la compréhension du processus de la lymphopoïèse humaine dans le modèle des cellules souches pluripotentes. En perspective, ces données pourraient avoir également un intérêt dans la modélisation de maladie de défauts génétiques de développement du système lymphoïde. / Human embryonic stem cells (hESC) are powerful tools to explore tissue genesis of the organism, especially hematopoietic tissue. In order to obtain cellular types clinically useful, the majority of works have been focalised on final output of hematopoietic cells, especially lymphoid cells (lymphocyte B, lymphocyte T and NK cells), from human pluripotent stem cells. However, the obtained hematopoietic cells yield is very poor. In the other hand, initial steps of hematopoiesis, especially the identification of the hematopoietic stem cell, myeloid and lymphoid progenitors, from pluripotent stem cells, are poorly defined. We were interested to early steps of lymphopoisis in the hESC model. Initially, we studied the role of HOXB4 homeprotein on CSEh-derived NK progenitor. We showed that exposure of embryoid body (EB), derived from hESC, to the modified line that express constitutively HOXB4 “MS-5/SP-HOXB4”, induce hESC-derived NK progenitor expansion. Furthermore, the derived NK cells are mature and fonctionnal, by cytolytic activity on erythro-leucemic line K562. Furthermore the effect of HOXB4 on NK progenitor expansion, this study demonstrated, particularly the role of MS-5 line on the lymphoid specification from hESC.Secondly, we analysed more precisely the early steps of human lymphopoiesis from hESC. We showed, in the first part, that MS-5 coculture of the EB-derived cells induce surface expression of CD45RA (marker of lymphoid specification) on hematopoietic progenitor CD34+. Thus, on the basis of these data and previous data concerning the initial steps of fetal and adult lymphopoiesis, we identified and characterized in vitro from hESC, two populations of multipotent early lymphoid progenitor (MELP): the CD34+CD45RA+CD7+ progenitor whose the differentiation potential is biased to T and NK lineage, and the CD34+CD45RA+CD7- progenitor has differentiation potential biased to B lineage. This study is essential in understanding of normal and pathological lymphopoisis process in pluripotent stem cells model. Additionally, this study paves the way for the modeling of genetic disorders of lymphoid system.

De nos jours, la greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) de type allogénique est le traitement standard pour de nombreuses hémopathies malignes, et ce, en dépit des taux élevés de complications liées à la transplantation, telles que les infections, les rechutes et la maladie du greffon contre l’hôte (GVH), associées à cette procédure. Depuis les deux dernières décennies, plusieurs stratégies visant à contrôler la maladie du GVH ont émergé et incluent la déplétion partielle et la manipulation ex vivo des cellules T du greffon. En revanche, ces stratégies peuvent entrainer de sévères déficits immunitaires post-greffe. En comparaison avec les autres sources de cellules souches, une faible incidence de la maladie du GVH et de rechute est observée chez les patients recevant une greffe de sang de cordon ombilical (SC). En contrepartie, ce type de greffe engendre des retards dans la restauration immunitaire, rendant ainsi les patients plus susceptibles aux agents pathogènes. À l’inverse, une augmentation plus importante de la production de cellules T naïves, d’émigrants thymiques récents et de l’abondance des clonotypes des cellules T fut détectée chez les patients ayant reçu une GCSH dérivée du sang d’un seul cordon traité avec UM171, une molécule utilisée pour l'amplification ex vivo des CSHs dérivés de SC, relativement aux patients ayant reçu une GCSH standard. Dans ce mémoire, nous essaierons de comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent à la restauration immunitaire chez les patients transplantés avec un greffon de SC traité avec UM171, nous tenterons de déceler des progéniteurs lymphoïdes au sein des cellules de SC traitées avec UM171 et nous essaierons d’identifier un marqueur de surface qui pourrait être utilisé pour enrichir les progéniteurs lymphoïdes. Nos résultats démontrent la présence de deux "clusters" lymphoïdes, PCL et LMPP, qui expriment potentiellement CD10, et sont plus nombreux dans les échantillons de SC CD34+ traités avec UM171 comparativement aux contrôles. En utilisant les marqueurs de surface CD10 et CD45RA, nous avons pu identifier deux populations CD34+ (CD10medCD45RAmed/lo et CD10hiCD45RAhi) qui sont multipliées dans les cultures traitées avec UM171 relativement aux contrôles. En outre, nous démontrons également que seules les cellules CD45RA- peuvent générer les deux populations CD10+ in vitro, ce qui suggère que les cellules CD10medCD45RAmed/lo définissent une population plus primitive que les cellules CD10hiCD45RAhi. De surcroit, nous proposons que la population CD10medCD45RAmed/lo pourrait contenir des LMPPs qui se différencieront en PCLs inclus dans la population CD10hiCD45RAhi. D'un point de vue fonctionnel, nous observons un développement et une maturation des lymphocytes T nettement plus rapide pour la population CD10+CD34+ relativement à la population CD34+ totale à 3 et 6 semaines, ce qui suggère que CD10 pourrait être utilisé comme marqueur de progéniteurs lymphoïdes. Par ailleurs, nous détectons également un pourcentage plus élevé de cellules ayant un phénotype ILC dans la population CD10+CD34+ comparativement à la population CD34+ totale, ce qui suggère que la population CD10+CD34+ peut potentiellement contenir des progéniteurs lymphoïdes capables de produire différents types de cellules immunitaires. D’autre part, la population CD45RA+ produit plus rapidement des lymphocytes T contrairement à la population CD45RA-. En conséquence, nous proposons que la population CD45RA- contient des cellules primitives (ex. CSH) qui à leur tour génèrent des progéniteurs multipotents contenus dans la population CD10+CD34+ (ex. LMPP) et qui éventuellement produiront des progéniteurs à potentiel plus restreint inclus dans la population CD45RA+ (ex. CLP). En somme, ce mémoire identifie pour la première fois une population CD10+CD34+ présente dans le greffon traité avec UM171 avec un potentiel T et produisant potentiellement des ILCs. L’un des problèmes majeurs liés à la GCSH dérivée du SC est une restauration immunitaire retardée; par conséquent, optimiser l’infusion de cellules CD34- en augmentant le nombre de progéniteurs lymphoïdes pourrait considérablement aider à stimuler la restauration immunitaire chez les patients recevant une GCSH dérivée de SC. / Currently, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a standard treatment for many hematological malignancies, although high rates of transplant-related complications such as infections, relapse, and GVHD has constrained the implementation of HSCT. Strategies have emerged to manage GVHD and include partial T-cell depletion and ex vivo manipulation of donor T cells, albeit they have adverse effects on post-transplantation immune recovery and can cause profound immunodeficiency. In comparison to other stem cell sources, a lower incidence of chronic GVHD and relapse is reported in patient receiving cord blood (CB) transplant, although they also display an enhanced susceptibility to pathogens caused by an ineffective T-cell reconstitution. In contrast, we reported a greater increase in naïve T cells production, recent thymic emigrants and T cell clonotype from 3 months to 6 and 12 months in patient transplanted with a single CB graft expanded with UM171, a small molecule used for the ex vivo expansion of CB HSCs, as compared to counterpart patients receiving unmanipulated CB graft. In this master research, we aimed to understand the molecular mechanism underlying T-cell reconstitution in patients transplanted with UM171- expanded CB graft. We tried to identify lymphoid progenitors within the highly heterogeneous CD34+ CB cells treated with UM171 using Cite-Seq, find a surface marker that can be used to enrich for early lymphoid progenitors using flow cytometry, and assess their lineage potential using artificial thymic organoids. Our results highlight the presence of two lymphoid clusters, CLP and LMPP, expressing CD10. The LMPP cluster is about 6 fold expanded in UM171-treated cells as compared to uncultured and DMSO-treated cells. Using the marker CD10 and CD45RA we identify two CD34+ populations (CD10medCD45RAmed/lo and CD10hiCD45RAhi) that are significantly expanded in CD34+ CB cells cultured in the presence of UM171 in contrast to uncultured CD34+ CB cells and DMSO-supplemented cultures. Furthermore, we demonstrate that only the CD45RA-negative cells can give rise to both CD10-positive subsets in vitro, suggesting that CD10medCD45RAmed/lo cells define a subset with a more primitive phenotype than CD10hiCD45RAhi. We propose that the CD10medCD45RAmed/lo subset could contain LMPPs that will commit to CLPs contained within the CD10hiCD45RAhi subset. Functionally, we compared T-cell development and maturation of the CD10+CD34+ subset (including CD10medCD45RAmed/lo and CD10hiCD45RAhi) to the CD45RA+CD34+, CD45RA-CD34+ and total CD34+ subsets and denote a faster T cell development and maturation at 3 and 6 weeks within the CD10-positive subset in contrast to the total CD34+ subset, suggesting that CD10 can be used as a marker of lymphoid precursors in UM171 cultures. We also observe a higher percentage of ILC-like cells within the CD10-positive subset as compared to total CD34+ cells suggesting that the CD10- positive subset potentially contains lymphoid precursors with multilineage capacity. Faster T cell development is observed for the CD45RA+ subset whereas CD45RA- cells display the slowest T cell development, hence we propose that the CD45RA- subset contains primitive cells (e.g. HSC) that segregate into lineage-biased multipotent progenitors enriched in the CD10-positive subset (e.g. LMPP) that will give rise to lineage-restricted precursors that are CD45RA+ (e.g. CLP). In sum, our findings represent the first identification of a CD10-positive population within the UM171- expanded graft that has T potential and could potentially produce ILCs. Delayed immune reconstitution is a major obstacle impeding the implementation of CB HSCT; therefore optimizing infusion of CD3+ donor cells by enriching for lymphoid precursors could help boost T-cell reconstitution following allogeneic HSCT.

L’allogreffe des cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans les situations d’incompatibilité HLA partielle représente une option thérapeutique irremplaçable pour des patients nécessitant une greffe de cellules souches hématopoïétiques, en absence d’un donneur HLA-identique. Toutefois, le retard de la restauration du système immunitaire en particulier dans du compartiment lymphocytaire après greffe est l'une des complications majeures. Une nouvelle stratégie pour promouvoir la reprise de la thymopoïèse à partir des CSH provenant du donneur et d'accélérer la reconstitution cellulaire T chez des patients après greffe de CSH consiste en le transfert adoptif des progéniteurs T générés in vitro. L’identification de Notch1 comme le régulateur-clé du développement lymphocytaire T a permis l’établissement de systèmes de culture à base de ligands de Notch, qui permettent la génération efficace de progéniteurs lymphoïdes T in vitro. L'efficacité des progeniteurs T-lymphoïdes murins pour promouvoir la reconstitution des lymphocytes T a été bien démontrée dans des modèles de greffe chez la souris. De même, des progéniteurs T-lymphopoïétiques humains générés in vitro et greffés aux souris humanisées favorisent la reprise de la thymopoïèse. Pourtant, aucune donnée n’a encore démontré leur capacité à donner naissance à un compartiment lymphocytaire T périphérique. De plus, les systèmes de co-culture à base de ligand de Notch actuellement utilisés consistent en des lignées stromales murines génétiquement modifiées. Afin d'établir un système cliniquement applicable, il est donc indispensable d’établir des systèmes de culture qui soutiennent la génération de progéniteurs T en absence d’un support des cellules nourricières. Au cours de mon projet de thèse, j'ai développé un nouveau système de culture pour la génération des progéniteurs T-lymphopoïétiques humains T basé sur l’immobilisation du ligand de Notch Delta-like-4 (DL-4) sous sa forme protéique. La culture des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issue de sang en présence de DL-4 immobilisé permet la génération d’un grand nombre de cellules ayant un phénotype de progéniteurs thymiques précoces (early thymic progenitor: ETP) et de prothymocytes (proT). Les cellules ETP et ProT ainsi générées expriment à des niveaux élevés des gènes impliqués dans le développement lymphocytaire précoce (i.e. pTa, Rag1, IL7Ra et BCL11b). Elles montrent des signes de réarrangement du récepteur des cellules T (TCR) similaires à leurs homologues thymiques. Par des expériences de dilution limite sur une co-culture OP9/DL-1 secondaire, j’ai pu montrer que les progéniteurs générés sur DL-4 possédaient un potentiel lymphoïde T très augmenté, qui pourrait être entièrement attribué aux sous populations ETP et ProT. Suite à leur transfert dans des souris NOD/SCID/γc-/-, les progéniteurs lymphoïde T générés par exposition a DL-4 sont capable de migrer dans le thymus, d’y poursuivre des étapes ultérieures de leur développement et d’accélérer la différentiation T intra thymique ainsi que l’émergence des lymphocytes T mature, polyclonaux et fonctionnels en périphérie. Dans une approche de co-transplantation, qui se rapproche des conditions cliniques envisagées, j’ai simultanément injecté dans le même récipient des progéniteurs générées sur DL-4 et des cellules CD34+ non traitées (d’un 2èm donneur HLA-incompatible). Cette procédure a permis une reconstitution des lymphocytes T encore plus rapide et plus. Etant donné que les progéniteurs T générées sur DL-4 et les cellules CD34+ non-traitées étaient issue de deux donneurs avec un HLA différent, cette expérience a permis de montrer que les progéniteurs préalablement exposés à DL-4 reconstituaient spécifiquement les compartiments lymphoïdes T alors que les autres lignées hématopoïétiques provenaient des progéniteurs CD34+ non-traités... / Human leukocyte antigen (HLA)-mismatched haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) represents an important therapeutic option for patients lacking suitable donors. Delayed posttransplant immune recovery constitutes one of its major complications and is most pronounced in the T cellular compartment. A novel strategy to promote de novo thymopoiesis from donor derived HSCs and to accelerate T cellular reconstitution in patients after HSCT consists in the adoptive transfer of in vitro generated T cell progenitor cells. Identification of Notch1 as the key regulator of early T-lineage development has allowed the generation of Notch ligand-based culture systems, which provide a powerful tool to generate T-lymphoid progenitors in vitro. The efficacy of murine T-lymphoid progenitors to promote T cell reconstitution has been well demonstrated in conventional mouse models. In consistency, in vitro-generated human T cell progenitors were demonstrated to promote thymic recovery in humanized mice. Yet, positive effects of in vitro generated human T cell precursors on peripheral T cell reconstitution have not been demonstrated. Moreover currently used Notch-based co-culture systems consist of genetically modified murine cell lines. With view to establishing a clinically applicable system, feeder-cell-free Notch-ligand culture systems for the generation of T-lymphopoietic progenitors are warranted. During my PhD project I developed a new culture system based on the immobilized Notch ligand Delta-like-4 (DL-4). Exposure of human CD34+ cord blood cells to immobilized DL-4 enabled the in vitro generation of high number of T cell progenitors, which harboured the phenotype of immature early thymic progenitor cells (ETP) and prothymocytes (proT). ETP and proT cell generated during DL-4 culture upregulated essential genes involved in early T-lymphoid development (i.e. IL7Rα, PTα, RAG1 and BCL11b) and had undergone stage-specific recombination of the T cell receptor (TCR) locus in a similar way as in native human thymopoiesis. In limiting dilution analysis after secondary OP9/DL-1 co-culture, DL-4 progenitors displayed a highly increased T-lymphoid potential, which could be entirely attributed to the ETP and proT subset. When transferred into NOD/SCID/γc-/- mice, DL-4 primed T cell progenitors migrated to the thymus and accelerated intrathymic T cell differentiation and emergence of functional, mature and polyclonal αβ T cells in the periphery. In a co-transplantation approach, which more closely mimics a clinical setting, DL-4 progenitors and untreated CD34+ cells from HLA-disparate donors were simultaneously injected in the same recipient. This procedure allowed even more rapid and more robust T cell reconstitution. HLA-tracking of the distinct graft sources further showed, that DL-4 progenitors specifically reconstituted the T-lymphoid compartments. This work provides further evidence for the ability of in vitro-generated human T cell progenitors to promote de novo thymopoiesis and shows for the first time, that these cells accelerate peripheral T cell reconstitution in humanized mice. The availability of the efficient feeder-cell-free DL-4 culture technique represents an important step towards the future clinical exploitation translation of in vitro generated T-lymphoid progenitor cells to improve posttransplant immune reconstitution / Die Wiederherstellung der T-lymphozytären Immunität nach T-Zell depletierter hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) ist ein langwieriger Prozess. Eine potentielle Strategie zur Beschleunigung der Neubildung von T-Zellen aus den transplantierten Stammzellen besteht in der Gabe von T-lymphozytären Vorläuferzellen. Die Entdeckung von Notch1 als wichtigster Regulator der frühen T-Zell-Entwicklung hat zur Etablierung Notchligand-basierter Zellkulturen geführt, mit deren Hilfe T-lymphoide Vorläuferzellen aus hämatopoetischen Stammzellen in vitro gebildet werden können. Das therapeutische Potential dieses Zelltyps wurde eindrucksvoll in konventionellen, syngenen und allogenen Maustransplantationsmodellen belegt, in denen nach Injektion in vitro generierter, muriner T-Vorläuferzellen eine Verbesserung der Neubesiedlung des Thymus sowie eine beschleunigte Wiederherstellung der T-zellulären Immunität erreicht werden konnte. Notchbasierte Co-Kultursysteme wurden ebenfalls für die invitro Herstellung humaner T-lymphoider Vorläuferzellen verwendet. Das in-vivo Potential humaner T Vorläuferzellen ist bislang jedoch nur lückenhaft charakterisiert: Zwar konnte gezeigt werden, dass humane T-Vorläuferzellen den hypoplastischen Thymus von immundefizienten NOD/SCID/γc-/- Mäusen besiedeln können. Ihre Wirksamkeit, die Wiederherstellung eines funktionellen, peripheren T-Zellkompartiments zu beschleunigen, gelang bislang jedoch nicht. Darüber hinaus werden Notchliganden in derzeit verwendeten Kultursystemen von genetisch modifizierten, murinen Stromazellen präsentiert. Die Entwicklung stromazellfreier, proteinbasierter Notchligand-Kultursysteme ist daher von grosser Bedeutung für eine mögliche therapeutische Nutzung in vitro generierter T-Vorläuferzellen. Durch Immobilisierung von Notchligand Delta-like 4 (DL-4) habe ich im Rahmen meines PhD Projekts ein stromazellfreies Kultursystem zur Züchtung T-zellulärer Vorläuferzellen aus humanen CD34+ Nabelschnurblutzellen etabliert. In DL-4 Kultur generierte Zellen besitzen phänotypische und molekulare Eigenschaften von frühen thymischen Vorläuferzellen (ETP) und Prothymocyten (proT). ETP und proT Zellen aus DL-4 Kulturen exprimieren wesentliche Geneder frühen T-Zellentstehung (z.B. IL7Ra, PTa, RAG1 und BCL11b). Die entwicklungsstadiumspezifischen TCR-Rekombinationsprozesse in DL-4 Zellen erfolgen nach dem gleichen Muster wie in der nativen Thymusentstehung. Die in DL4 Kultur generierten T-Vorläuferzellen können sich in reife T-Zellen weiterentwickeln und durchlaufen die weitere T-Zelldifferenzierung innerhalb kürzerer Zeit als native CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen. 13 Darüber hinaus können DL-4 generierte T-Vorläuferzellen nach Xenotransplantation den hypoplastischen Thymus von immundefizienten NOD/SCID/γc-/- Mäusen besiedeln, intrathymische T-Zellentwicklung begünstigen und die Neubildung reifer und funktionaler TZellen in der Peripherie beschleunigen. Zur Simulation einer klinischen Anwendung führte ich weiterhin Co-Transplantationen mit DL-4 Vorläuferzellen und unbehandelten CD34+ Zellen in gleiche Empfänger durch und konnte hiermit eine weitere Verbesserung der Immunrekonstitution erzielen. Durch Verwendung HLA-divergenter Spender in diesen Versuchen konnte ich zeigen, dass DL-4 Zellen sich vornehmlich in T-Zellen weiterentwickelten, während die restlichen Blutzellreihen von unbehandelten CD34-poitiven Zellen gebildet wurden. Im Rahmen dieses Projekts konnte ich mit einem für die klinische Anwendung geeigneten Kulturmodell wichtige präklinische Belege für das therapeutische Potential in vitro generierter TVorläuferzellen erbringen. Diese Arbeit bildet somit eine wichtige Grundlage für eine zukünftige klinische Anwendung von T-Vorläuferzellen zur Verbesserung der T-Zell-Immunität nach HSZT