In den vergangenen Jahren sind Lipide, Membranen und deren Organisationsformen mehr und mehr in den Fokus der biologischen Forschung gerückt. Es wurde vorgeschlagen, dass in zellulären Membranen selbstassemblierende, submikroskopische Aggregate aus Sphingolipiden, Cholesterol und bestimmten Proteinen existieren und man vermutet, dass insbesondere Viren diese “Lipid Rafts” für ihren Zusammenbau nutzen und auf diese Art ihre Proliferationseffizienz erhöhen. Gleichwohl sind die genaue biologische Funktion und auch die molekulare Basis der Assoziation bestimmter Protein mit Lipid Rafts auch weiterhin unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie genutzt, um die Lipid-Raft-Anreicherung des HIV-1 Glycoproteins gp41 zu untersuchen. Förster-Resonanz-Energietransfer zwischen fluoreszenzmarkierten viralen und Raft-Marker-Proteinen wurde gemessen, um deren gemeinsame, lokale Aufkonzentrierung in Lipid Rafts nachzuweisen. Durch Verwendung verschiedener Deletions- und Mutationsvarianten des Proteins konnte nicht nur seine Lipid-Raft-Präferenz demonstriert, sondern auch das Cholesterol-Bindemotiv (CRAC) als entscheidender Faktor der lateralen Sortierung identifiziert werden. Wir haben in diesem Kontext auch eine systematische Zell-zu-Zell-Variabilität in unseren Daten bemerkt, die einen zugrundeliegenden zellbiologischen Mechanismus der Membranorganisation nahelegt. Mithilfe von Fluoreszenz-Polarisations-Mikroskopie konnte zudem eine klare CRAC-Abhängigkeit der gp41-Oligomerisierung aufgezeigt werden. Die von uns gewonnenen Daten erlauben einen tieferen Einblick in die molekulare Basis und die biologischen Folgen der cholesterol-abhängigen lateralen Proteinorganisation für Virusassemblierungsprozesse an biologischen Membranen. / In recent years, there has been a considerable interest in the molecular organization of biological membranes. It has been hypothesized that self-assembling, freely diffusing, submicroscopic domains consisting of sphingolipids, cholesterol and certain proteins exist and the prevailing view is that those lipid rafts serve as platforms for specific molecular interactions by the preferential exclusion and inclusion of proteins. It was presumed, that in particular viruses make use of plasma membrane lipid rafts to augment the infection process and spread efficiently. However, the exact biological function and physical basis of protein partitioning into microdomains remains an outstanding question in virus biology. In the present study, fluorescence lifetime imaging microscopy was used to study lipid raft partitioning of the HIV-1 glycoprotein gp41 by detecting Foerster Resonance Energy Transfer between fluorescently labeled viral and raft marker proteins in living cells. Plasma membrane microdomain association of gp41 was demonstrated and by introducing systematic mutations and truncations in different gp41 motifs, the cholesterol recognition amino acid consensus (CRAC) was identified as the crucial determinant of the lateral sorting. Interestingly, we observed a systematic cell-to-cell variability in our raft related data that suggests underlying cell-biological mechanisms of membrane organization. Moreover, fluorescence polarization microscopy revealed a distinct CRAC requirement for gp41 oligomerization whereas other properties, such as intracellular distribution and expression efficiency were clearly demonstrated to be CRAC independent. Our data provide further insight into the molecular basis and biological implications of the cholesterol dependent lateral protein sorting for virus assembly processes at cellular plasma membranes.