Stuttgart, Univ., Diplomarbeit, 2002.

Erlangen-Nürnberg, Univ., Diss., 2010.

Univ., Diss., 2010--Bayreuth.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Obwohl sie die Mehrzahl der T-Zell-Lymphome darstellen, war über die Genetik der PTC-NOS und ALK-negativen ALCL bisher nur wenig bekannt. Klassische zytogenetische Untersuchungen dieser Gruppe wiesen auf komplexe chromosomale Veränderungen hin. Aufgrund der Seltenheit dieser Neoplasien basierten die Berichte bis jetzt nur auf einer geringen Anzahl von Fällen. Für die heterogene Gruppe von PTCL-NOS konnten bisher keine charakteristischen genetischen Veränderungen beschrieben werden. Zudem waren die genetische Beziehung zwischen ALK-negativen ALCL und PTCL-NOS, die Genetik von kutanen ALCL und die sekundären genetischen Veränderungen in ALK-positiven ALCL unklar. In dieser Untersuchung wurden 42 PTCL-NOS und 37 ALCL, davon 17 anaplastisch-großzellige Kinase (ALK)-negative ALCL, 9 ALK-positive ALCL und 11 kutane ALCL, durch komparative genomische Hybridisierung analysiert und charakteristische rekurrente genetische Alterationen nachgewiesen. Unter 36 primär diagnostizierten PTCL-NOS fanden sich rekurrente chromosomale Verluste auf den Chromosomen 13q (minimal überlappende Region 13q21, 36% der Fälle), 6q und 9p (6q21 und 9p21-pter, in 31% der Fälle), 10q und 12q (10q23-24 und 12q21-q22, in 28% der Fälle) und 5q (5q21, 25% der Fälle). Rekurrente Zugewinne wurden auf Chromosom 7q22-qter (31% der Fälle) gefunden. In 11 PTCL-NOS wurden High-level-Amplifikationen beobachtet. Bei den PTCL-NOS konnte zudem eine Gruppe von nicht-zytotoxischen nodalen CD5-positiven T-Zell-Lymphomen abgegrenzt werden, die durch rekurrente chromosomale Verluste auf den Chromosomen 5q, 12q und 10q charakterisiert ist. Während kutane und ALK-positive ALCL wenige rekurrente chromosomale Veränderungen zeigten, fielen bei ALK-negativen ALCL wiederholt Zugewinne auf Chromosom 1q (1q41-qter, 46%) und Verluste auf Chromosom 6q (6q21, 31%) und 13q (13q21-q22, 23%) auf. Insgesamt können somit PTCL-NOS von ALK-negativen ALCL durch Verluste auf den Chromosomen 5q und 9p (bei PTCL-NOS) sowie durch Zugewinne auf Chromosom 1q (bei ALCL) abgegrenzt werden. PTCL-NOS und ALK-negative ALCL unterscheiden sich genetisch außerdem von anderen T-NHL, wie Enteropathie-assozierte T-Zell-Lymphome, Prolymphozyten-Leukämien vom T-Zell-Typ und adulte T-Zell-Leukämien/Lymphomen. / Although representing the majority of T-cell lymphomas, the genetics of PTCL NOS and ALK-negative ALCL are only poorly characterized so far. Classical cytogenetic studies have demonstrated a high degree of chromosomal complexity. Because of the rarity of these neoplasms, most reports were based on a small number of cases only. For the heterogeneous group of PTCL NOS, no characteristic genetic alterations have been defined so far. In addition, the genetic relationship between ALK-negative ALCL and PTCL NOS, the genetics of cutaneous ALCL, and the secondary genetic alterations in ALK-positive ALCL have remained enigmatic so far. In this study 42 PTCL NOS and 37 ALCL [17 anaplastic large cell kinase (ALK)-negative ALCL, 9 ALK-positive ALCL, 11 cutaneous ALCL] were analyzed by comparative genomic hybridization. Among 36 de novo PTCL NOS, recurrent chromosomal losses were found on chromosomes 13q (minimally overlapping region 13q21, 36% of cases), 6q and 9p (6q21 and 9p21-pter, in 31% of cases each), 10q and 12q (10q23-24 and 12q21-q22, in 28% of cases each), and 5q (5q21, 25% of cases). Recurrent gains were found on chromosome 7q22-qter (31% of cases). In 11 PTCL NOS, high-level amplifications were observed. Whereas cutaneous ALCL and ALK-positive ALCL showed few recurrent chromosomal imbalances, ALK-negative ALCL displayed recurrent chromosomal gains of 1q (1q41-qter, 46%), and losses of 6q (6q21, 31%) and 13q (13q21-q22, 23%). Losses of chromosomes 5q, 10q, and 12q characterized a group of noncytotoxic nodal CD5+ peripheral T-cell lymphomas. Losses of chromosome 5q and 9p (PTCL) and gains of chromosome 1q (ALCL) may segregate PTCL NOS from ALK-negative ALCL. The genetics of PTCL NOS and ALK-negative ALCL differ from other T-NHLs characterized genetically so far, among them enteropathy-type T-cell lymphoma, T-cell prolymphocytic leukemia, and adult T-cell lymphoma/leukemia.

MicroRNAs sind kurze, nicht-kodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle bei der Genregulation spielen. Sie sind an vielen physiologischen Prozessen beteiligt und werden als vielversprechende Kandidaten für eine neue Generation von Biomarkern gehandelt. Die Quantifizierung von miRNAs aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten verspricht eine frühe Diagnose verschiedener Krankheitsbilder. Dazu zählen neben zahlreichen Krebsformen unter anderem auch Autoimmun- oder Herz-Kreislauferkrankungen. Um diese Biomarker schnell, sensitiv und spezifisch detektieren zu können, werden geeignete Detektionssysteme benötigt. Dabei liegt ein besonderer Fokus auf der Entwicklung von Point-of-Care-Systemen, die eine automatisierte Durchführung mit einfacher Handhabung verlangen. Mikrochips können als leistungsfähige technische Hilfsmittel für eine robuste und miniaturisierte Signalerfassung an biochemischen Grenzflächen dienen. Auf der Grundlage eines CMOS-Chips mit einem Sensorarray aus interdigitalen Gold-Elektroden sollte in dieser Arbeit eine quantitative und multiplexfähige miRNA-Detektionsmethode mit elektrochemischer Signaltransduktion entworfen und untersucht werden. Weitere wichtige Zielfaktoren waren eine einfache und schnelle Durchführbarkeit, eine hohe Spezifität und eine gute Sensitivität bei gleichzeitigem Verzicht auf Amplifikation und Vormarkierung des Ausgangsmaterials. Es wurden verschiedene Methoden entworfen, überprüft, untersucht, optimiert und weiterentwickelt. Das beste Ergebnis wurde letztlich mit einem als Sandwich-Ligations-Methode bezeichneten Verfahren erzielt. Dabei wird zunächst ein aus zwei doppelsträngigen Assay-Komponenten und der Ziel-miRNA bestehender dreiteiliger Hybridisierungskomplex gebildet, der eine beidseitige spezifische Ligation der miRNA mit einem auf der Sensoroberfläche immobilisierten Fängerstrang und einem enzymmarkierten Reporterstrang vermittelt. Durch einen anschließenden Waschschritt werden alle überschüssigen Markierungen vom Detektionsbereich entfernt, so dass bei der Detektion nur Reporterenzyme ausgelesen werden, die über die Ziel-miRNA kovalent mit dem immobilisierten Strang verbunden sind. Dieses Signal ist daher proportional zur Ausgangskonzentration der gesuchten miRNA. Die Methode wurde mit Hilfe von synthetischen miRNAs etabliert und optimiert. Sie erreichte eine analytische Sensitivität von unter 1 pM Ziel-Nukleinsäure bei einer Gesamt-Versuchsdauer von nur 30 Minuten. Konzentrationsreihen demonstrierten einen linearen dynamischen Messbereich zwischen 1 pM und 1 nM, der eine verlässliche Quantifizierung der detektierten miRNAs in diesem Bereich ermöglicht. Die sehr gute Spezfifität des Assays zeigte sich bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener IsomiRs auf das Messergebnis sowie im Rahmen von Experimenten mit miRNAs der let-7-Familie. Dabei konnten Ziel-Nukleinsäuren mit Einzelbasenunterschieden klar differenziert werden. Die Multiplexfähigkeit der vorgestellten Methode wurde durch die gleichzeitige Quantifizierung von bis zu acht miRNAs auf einem CMOS-Chip demonstriert, zuzüglich Kontrollen. Die Validierung der Detektionsmethode erfolgte mit Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblutproben. Dazu wurde ein kardiales Panel aus acht miRNAs, die auf Basis von Studien zu zirkulierenden miRNAs bei Herzerkrankungen ausgewählt wurden, festgelegt. Mit Hilfe der entsprechenden optimierten Detektionskomponenten wurden aus Spenderblut gewonnene endogene miRNAs analysiert. Dabei zeigte sich für fünf der acht Kandidaten sowohl eine solide Korrelation zwischen eingesetzter Gesamt-RNA-Menge und Messsignal, als auch eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Die Konzentrationen der übrigen drei miRNAs lagen nah am unteren Detektionslimit und lieferten daher keine verlässlichen Daten. Mit Hilfe sogenannter branched DNA zur Signalamplifikation könnte bei Bedarf die Sensitivität des Assays noch verbessert werden, was durch weitere Experimente dieser Arbeit demonstriert wurde. Ein Vergleichsexperiment zwischen der Sandwich-Ligations-Methode und qRT-PCR zeigte nur eine schwache Korrelation der Messergebnisse. Dies ist jedoch konsistent mit anderen Studien zur Vergleichbarkeit unterschiedlicher Detektionsmethoden. Abschließend wurden die miRNAs des kardialen Panels in Gesamt-RNA-Extrakten aus Vollblut von Herzinfarktpatienten und Kontrollen mit der entwickelten Detektionsmethode analysiert und die Ergebnisse verglichen. Dabei konnten Abweichungen in den Konzentrationen von miR-15a und miR-425 aufgedeckt werden. Eine entsprechende diagnostische Untersuchung mit der hier vorgelegten und validierten Detektionsmethode könnte eine Alternative oder Ergänzung zu aktuell eingesetzten proteinbasierten Tests bieten. / MicroRNAs are short, non-coding ribonucleic acids that play an important role in gene regulation. They are involved in many physiological processes and therefore considered as auspicious candidates for a new generation of biomarkers. The quantification of miRNAs from blood or other body fluids promises early diagnosis of various diseases, including autoimmune disorders, cardiovascular disease as well as different types of cancer. For a fast, sensitive and specific detection of these biomarkers, suitable detection systems are needed. A particular focus is thereby on the development of point-of-care systems, which require an automatized work-flow with easy handling. Microchips are powerful technical tools for a robust and miniaturized signal acquisition at biochemical interfaces. Based on a CMOS chip providing an array of interdigitated gold electrode sensors, a quantitative multiplex miRNA detection method with electrochemical readout should be designed and investigated in this work. A fast and easy workflow, a high specificity and a good sensitivity without amplification or prelabeling of the target material were additional important goals. Several approaches were designed, tested, investigated, optimized and refined. In the end a method labeled as Sandwich Ligation Assay provided the best results. In this procedure, a tripartite hybridization complex is created by two double-stranded assay components and the target nucleic acid. This formation mediates a specific both-sided ligation of the miRNA to an immobilized capture strand on the sensor surface and to an enzyme-linked reporter strand. A subsequent washing step removes all excessive label conjugates from the sensor array. Thus only reporter enzymes that are covalently bound to the immobilized capture strand via the target miRNA are measured during detection. The acquired signal is therefore proportional to the initial concentration of the respective target. The Sandwich Ligation Assay was established and optimized using synthetic miRNAs. A sensitivity of less than 1 pM nucleic acid target could be achieved at a time to result of only 30 minutes. Generated concentration curves showed a linear dynamic range between 1 pM and 1 nM allowing a reliable quantification of detected miRNAs in this scope of measurement. Experiments with miRNAs of the let-7 family that exhibited only one or two nucleotide differences demonstrated a very good specificity of the presented method, as did the investigation of the influence of IsomiRs on the measurement signal. The ability of multiplex measurement was verified by the simultaneous quantification of up to eight miRNAs plus controls on one CMOS chip. The detection method was validated using total RNA extracts gained from whole blood samples. Therefore a cardiac panel composed of eight miRNA candidates was assorted by leveraging the results of studies about circulating miRNAs in heart disease. The optimized corresponding detection components were used to analyze endogenous miRNAs from donor blood. Five of the eight candidates showed a solid correlation between the applied amount of total RNA and the measurement signal as well as a good reproducibility of results with CV values ranging from 0.04 to 0.13. The concentrations of the three remaining miRNAs were too close to the lower detection limit and hence didn’t provide reliable data. A signal amplification using so-called branched DNA can be integrated into the measurement procedure to further enhance the sensitivity of the assay, if required. This was demonstrated by additional experiments of this thesis. A comparison between the Sandwich Ligation Assay and qRT-PCR showed only weak correlation of measurement results, which is in line with previous studies about interplatform comparability. Finally, the miRNAs of the cardiac panel were analyzed in total RNA samples extracted from whole blood of patients with myocardial infarction and controls using the established detection method. By comparison of the results dysregulations of the particular miRNAs miR-15a and miR-425 could successfully be identified. A respective diagnostic test using the proposed measurement procedure could provide an alternative or a complement to the currently applied immunoassays.

Thesis (doctoral)--Freie Universität Berlin, X.

Zugl.: Marburg, Univ., Diss., 2005

Heidelberg, Univ., Diss., 2007.

Zugl.: Karlsruhe, Univ., Diss., 2006