Hypereosinophilic (HES) syndrome is an umbrella term encompassing several disease subsets that affects humans and veterinary species, ultimately resulting in >1,500 eosinophils/uL circulating in the blood documented over six-months. This eventually culminates in end-organ infiltration and increased patient morbidity and mortality. In mice where the gene Map3k14 encoding NF -kB inducing kinase (NIK) is knocked out, a HES-like syndrome develops that is dependent on Th2 cells and cytokines. NIK is the upstream regulator of the noncanonical NF-kB pathway and is involved in lymphoid organ development, B cell lymphopoiesis, and myelopoiesis. In addition to regulating the noncanonical NF-kB pathway, NIK is also involved in regulation of kB dimers of the canonical NF-kB pathway and can function independent of NF-kB signaling by regulating lipid and glucose metabolism, mitochondrial, and RIP1 binding to influence cell survival and death. Despite previous studies performed in the Nik-/- model, the mechanisms underlying eosinophil development, plasticity, and fitness in conjunction with the bone marrow and splenic microenvironments have not been fully elucidated. In the present work, we reviewed current data exploring the influence of the noncanonical NF-kB pathway and NIK specifically on the development of acute myeloid leukemias (AMLs) and Myelodysplastic Syndrome (MDS) with a focus on how these mechanisms might induce subvariants of HES. We next examined the effect of NIK loss on eosinophilopoiesis within hematopoietic tissues in vivo and in various cell culture environments in vitro via cytology, histology, flow cytometry, FACS, positive cell selection, MTT assay, BrDU assay, and protein microarray analysis. Overall, our findings suggest that NIK influences eosinophil maturation, proliferation, metabolism, survival, and potentially plasticity in vivo and in vitro under different environmental conditions and Th2 cytokine influence. NIK loss was also associated with altered free and bound TNFR1 levels on day 13 in vitro. TNFR1 acts upstream of RIP1 and suggests that these differences may be due to NF-kB independent functions of NIK. Overall, these results provide further insight into the potential mechanisms underlying eosinophilopoiesis in the Nik-/- murine model. This information may prove useful in discovering new treatment options underlying subvariants of HES in both human and veterinary patients. / Doctor of Philosophy / A less well-known albeit important white blood cell (WBC) is the eosinophil. It is essential for combating parasitic infections but is also involved in allergic responses. Hypereosinophilic Syndrome (HES) is an umbrella term encompassing a variety of diseases that affects human and veterinary patients. It results in an overproduction of eosinophils not associated with parasitic infections or allergic responses. Although several variants of the disease exist, diagnosing subsets of HES poses a diagnostic challenge and can impact patient care and prognosis long term. Mice carrying a genetic deletion (Map3k14) encoding a kinase known as NF-kB inducing kinase (NIK) develop HES-like syndrome; these mice are hereafter referred to as Nik-/- mice. HES-like syndrome in Nik-/- mice develops secondary to NIK loss in Th2 lymphocytes (another type of WBC). NIK is an upstream regulator of the noncanonical NF-kB pathway that influences WBC, lymph node, and spleen development. NIK also regulates canonical NF-kB molecules and can function independent of NF-kB signaling by impacting fat and glucose metabolism, binding to mitochondria, and interacting with a kinase known as RIP1 to regulate cell death or survival. Despite previous work studying HES-like syndrome in Nik-/- mice, the specifics of the bone marrow and eosinophil development in response to Th2 cells have not been fully characterized. In the present work, we reviewed data exploring the noncanonical NF-kB pathway and NIK specifically in the development of WBC cancers and how this might manifest as HES. We then studied eosinophil development in the bone marrow, spleen and in culture for both Nik-/- and wild-type mice by assessing cell and tissue morphology, cell surface marker expression, response to Th2 signaling molecules, as well as cell maturation, death, metabolism, proliferation, and cytokine production. Our findings suggest that NIK is essential for eosinophil growth and survival. We also noted differences in a molecule known as TNFR1 in Nik-/- cultures on day 13. This molecule acts upstream of RIP1, suggesting an NF-kB independent function of NIK in regulating eosinophil maturation in response to Th2 molecules. This information may prove useful in discovering new treatments for HES in human and veterinary patients.

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Le syndrome hyperéosinophilique dit "lymphoïde" avec cellules T circulantes CD3-CD4+ (SHE-L CD3-CD4+) se caractérise par une hyperéosinophilie secondaire à la présence d'un clone lymphocytaire T producteur de cytokines comme l'IL-5. Trente patients seulement ont été rapportés dans la littérature, neuf d'entre eux ont présenté un lymphome T périphérique au cours du suivi. Il n'existe aucune grande série de la littérature décrivant les données cliniques, les caractéristiques immunophénotypiques, histopathologiques et moléculaires de la maladie. Le travail de Thèse a permis de confirmer la prédominance des manifestations cutanées et ganglionnaires dans le SHE-L CD3-CD4+, mais également d'autres atteintes d'organes dont l'infiltrat à éosinophiles a été démontré (poumon, tube digestif, glande lacrymale, parotide, synoviale). Les cellules CD3-CD4+ circulantes peuvent être détectées à des taux extrêmement variables, des plus faibles (<1% des lymphocytes circulants) ne devant pas être négligés, aux plus élevés (>90% des lymphocytes circulants) ne devant pas faire évoquer systématiquement une hémopathie maligne. Nous décrivons également les 2 premiers cas de lymphomes angio-immunoblastiques (LAI) survenant au cours du SHE-L CD3-CD4+. Nous avons ensuite pu décrire pour la première fois les caractéristiques histopathologiques ganglionnaires et extra-ganglionnaires (peau, tube digestif,...) du SHE-L CD3-CD4+. Nous décrivons des caractéristiques ganglionnaires et cutanées très similaires au LAI qui soulignent les difficultés du diagnostic différentiel. Nous démontrons également la persistance du même clone lymphocytaire T dans le sang et les tissus lésés sur des prélévements espacés de plusieurs années pour un patient donné (maximum: 23 ans). Enfin, les caractéristiques immunophénotypiques des cellules T circulantes (expression du CD2, CD5, CD7, TCRalphabeta) sont très proches de celles observées dans le LAI. L'ensemble de ces données définissent le SHE-L CD3-CD4+ comme un syndrome lymphoprolifératif clonal T indolent périphérique, à ne pas confondre avec le LAI. Nous proposons des éléments de diagnostic différentiel comme l'expression du CD10 et des marqueurs CXCL13 et PD1 (marqueurs dits "T helper folliculaire"), absents dans le SHE-L mais spécifiques du LAI. La dernière partie du travail de Thèse a porté sur la caractérisation moléculaire du SHE-L CD3-CD4+ par une approche type single nucleotid polymorphism array (SNPa, n=4 patients) en complément d'une étude antérieure par une approche type comparative genomic hybridization array (CGHa, n=1 patient). La comparaison du génome complet des cellules CD3-CD4+ et CD3+CD4+ par SNPa pour un patient donné, a permis d'identifier une zone commune de perte d'hétérozygotie sur le bras long du chromosome 7. L'identification par CGHa d'un gain sur le même segment chromosomique chez un autre patient permet de restreindre la zone d'intérêt à un segment chromosomique porteur de 77 gènes. Des compléments d'investigation (SNPa) sont en cours afin de restreindre le segment chromosomique d'intérêt et d'identifier le gène muté en cause par des méthodes de séquençage. Cette approche devrait permettre d'identifier pour la première fois les mécanismes moléculaires à l'origine de l'émergence du clone lymphocytaire T dans le SHE-L CD3-CD4+. En conclusion, le travail de Thèse a permis d'apporter des éléments nouveaux dans le diagnostic du SHE-L CD3-CD4+, d'en décrire les caractéristiques histopathologiques et immunophénotypiques en faveur d'un syndrome lymphoprolifératif T clonal indolent périphérique, sans équivalent dans la classification OMS actuelle des hémopathies. Enfin, nous espérons pouvoir identifier un ou des gènes d'intérêt, et proposer des mécanismes moléculaires en cause dans ce syndrome lymphoprolifératif clonal T. / The CD3-CD4+ lymphoid variant of hypereosinophilic syndrome (CD3-CD4+ L-HES) is defined by a hypereosinophilia secondary to a clonal T-cell subset producing cytokines like interleukine-5. Only thirty patients have already been described, nine of them have developed a T-cell lymphoma during follow-up. No large series has described clinical features and immunophenotypic, histopathological and molecular characteristics of the disease. This work confirmed the predominance of skin and lymph nodes involvement in CD3-CD4+ L-HES, but also of other organs in which eosinophils infiltrates were demonstrated (lung, digestive tract, lachrymal gland, parotid, synovium). CD3-CD4+ circulating T-cells can be detected at very low level (<1% of total lymphocytes) which should not be neglected, or at very high level (>90% of total lymphocytes) which should not considered as a malignant disorder. We also describe the two first cases of angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) occurred in CD3-CD4+ L-HES. We have also described for the first time the nodal and extra nodal histopathological characteristics of CD3-CD4+ L-HES, which are similar to AITL and which highlight the difficulty of differential diagnosis. We also demonstrate the same T-cell clone in blood and damaged tissues in samples spaced up for several years (maximum 23 years). Secondly, immunophenotypic characteristics of circulating T-cells (CD2, CD5, CD7, TCRalphabeta) are really closed to those of circulating T-cells in AITL. Overall, our data define CD3-CD4+ L-HES as a peripheral indolent clonal T-cell lymphoproliferative disorder, which should not be confused with AITL. We suggest some differential diagnosis tools like CD10 and Tfh markers (CXCL13, PD1) which are absent in CD3-CD4+ L-HES but specific of AITLThe last part of the work focused on the molecular characterization of the CD3-CD4 + L-HES by a single nucleotid polymorphism array approach (SNPa, n = 4 patients) in complement of an earlier study using comparative genomic hybridization array approach (CGHa, n = 1 patient). The comparison of the full genome of CD3-CD4 + and CD3+CD4+ T-cells in a given patient identified a common segment of loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 7. Identification by CGHa of a gain on the same chromosomal segment in another patient allows restricting the area of interest to a chromosomal segment which represents 77 genes. Complementary investigations (SNPa) are underway to restrict the chromosomal segment of interest and identify the potential mutated genes by sequencing methods. This approach should identify for the first time the molecular mechanisms underlying the emergence of clonal T-cells in the CD3-CD4 + L-HES.In conclusion, the work brings some new usefull features for the diagnosis of CD3-CD4+ L-HES, describes some histopathological and immunophenotypic features in favor of a peripheral indolent clonal T-cell lymphoproliferative disorder, without any equivalent in the 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms. Finally, we hope to identify one or more genes of interest, and to propose some molecular mechanisms involved in this clonal lymphoproliferative T-cell disease.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T. Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T. Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou 9 encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome. La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T.<p>Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou<p>9<p>encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome.<p>La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished