La levure Candida albicans présente une tolérance élevée aux réarrangements de son génome et en particulier, aux pertes d’hétérozygotie (LOH). Ces LOH sont le plus souvent le résultat de la réparation d’une cassure double-brin de l’ADN (DNA DSB) et jouent un rôle important dans différents aspects de la biologie de C. albicans. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine des LOH, nous avons combiné un système d’induction d’un DNA DSB par la méganucléase I-SceI et un système rapporteur de LOH optimisé pour l’analyse par FACS. La surexpression de I-SceI entraine une forte augmentation du taux de LOH, principalement des conversions géniques. La caractérisation des cellules ayant subi une LOH a permis d’identifier des allèles récessifs délétères et létaux présents à l’état hétérozygote dans le génome de la souche de laboratoire de C. albicans. Ces allèles influent sur la nature des LOH observés suite à un DNA DSB. Nous avons également caractérisé la fidélité de la réparation d’un DNA DSB induit par I-SceIchez C. albicans. Cette étude a permis de décrire des recombinaisons complexes et inattendues se déroulant pendant les événements de break-induced replication et de conversions géniques avec crossover. En parallèle, une collection de 564 plasmides de surexpression pour des gènes impliqués dans les voies de signalisation et dans l’intégrité du génome et de la paroi a été transformée dans une souche possédant les deux systèmes mentionnés ci-dessus. L’analyse des transformants dans des conditions ou non d’expression de I-SceI a permis d’identifier des gènes dont la surexpression augmente le taux basal de LOH ou diminue le taux de LOH élevé du à l’expression d’I-SceI. / The Candida albicans genome displays a high tolerance to rearrangements, notably loss-ofheterozygosity (LOH) events. These events most often result from the repair of DNA double-strandbreaks (DSBs) and are known to play an important role in different aspects of C. albicans biology.To study the molecular mechanisms leading to LOH, we have combined an I-SceI meganuclease-dependent DSB-inducing system with a FACS-optimized reporter system of LOH. Our results show that expression of I-SceI leads to a dramatic increase in the frequency of LOH events,mainly gene conversion events. Characterization of cells having undergone a LOH led us to identify recessive lethal and deleterious alleles present in the heterozygous state in the genome of the C.albicans laboratory strain. These alleles influence the nature of the LOH events that are observed following a DSB. We also characterized the fidelity of the repair following an I-SceI-induced DNA DSB. This revealed unexpected complex recombination events occurring upon both break-induced replication and gene conversion with crossover repair events. In parallel, a collection of 564 over expression plasmids for genes involved in signaling pathways, genome integrity and cell wall integrity has been transformed in a C. albicans strainharboring the I-SceI-dependent DSB-inducing system and FACS-optimized LOH reporter. Analyses of the resulting transformants under conditions that allowed fro I-SceI expression or not, led to the identification of genes whose overexpression results either in an increase of the basal LOH rate or in areduction of the high LOH frequency associated to I-SceI expression.

La recombinaison homologue est un mécanisme de réparation de l’ADN extrêmement contrôlé et particulièrement chez les eucaryotes supérieurs. Dans les cellules méiotiques de ces derniers, où les cassures doubles brin de l’ADN sont programmées, les voies de crossing-over de la recombinaison homologue, qui génèrent de nouvelles combinaisons de gènes, sont restreintes. Dans les cellules somatiques, la recombinaison illégitime, qui assure majoritairement la réparation des cassures double brin de l’ADN, limite l’intégration ciblée du transgène par recombinaison homologue. Les entreprises de biotechnologie convoitent de maitriser la recombinaison homologue afin de contrôler d’une part le brassage génomique qui a lieu pendant la méiose, et d’autre part l’intégration du transgène dans le génome. Cette étude a porté sur le développement d’outils afin d’atteindre ces deux objectifs. Afin d’augmenter le brassage du génome, ayant lieu pendant la méiose, une version du promoteur OsDmc1b, active dans les cellules méiotiques, a été caractérisée chez le maïs. Des plantes sur-exprimant le gène ZmSpo11.1, sous contrôle de ce promoteur, ont ainsi été développées afin d’obtenir des lignées potentiellement hyper-recombinantes. Si la surexpression de ZmSpo11.1 permet effectivement d’augmenter le taux de crossing-over, il pourra être utilisé par les sélectionneurs afin d’accélérer l’introgression d’allèles d’intérêt dans des variétés élites. Concernant la mise en place d’une technique de ciblage de gène, deux stratégies, reposant sur l’utilisation de la méganucléase I-SceI, ont été testées. La démarche a nécessité trois éléments : un locus cible contenant le site de coupure I-SceI, une matrice de réparation et la séquence codant I-SceI (ou I-SceI::GR). La première stratégie, consistant à retransformer les lignées présentant le locus cible avec la matrice de réparation et I-SceI, ne semble pas exploitable car aucun évènement de ciblage de gène n’a été mis en évidence. La seconde stratégie, reposant sur l’assemblage des trois éléments par croisement, est beaucoup plus prometteuse. Malgré la faible activité d’I-SceI::GR, des évènements de recombinaison homologue ont été observés dans les tissus foliaires de certaines plantes. Du cal embryogène, développé à partir de ces dernières, a permis de régénérer des plantes présentant des évènements de ciblage de gène. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans l’élaboration contrôlée d’OGM. / Homologous recombination is a DNA repair mechanism highly regulated in higher eukaryotes. In their meiotic cells, where DNA double-stranded breaks are programmed, the crossing-over pathway of homologous recombination, which generates new gene combinations, is limited in activity and genomic distribution. In somatic cells, illegitimate recombination, which mainly ensures DNA double-strand repair, limits the targeted integration of transgenes by homologous recombination. Biotechnology companies aim to master homologous recombination to control on the one hand the genomic mixing that occurs during meiosis, and on other hand, the integration of transgenes into the genome. This study focuses on the development of tools to achieve these two objectives.To increase genome mixing occurring during meiosis, a version of the OsDmc1b promoter active in maize meiotic cells was isolated. Then, plants over-expressing the ZmSpo11.1 gene under control of this promoter have been developed to obtain potentially hyper-recombinant lines. If ZmSPO11.1 overexpression increases the crossing over rate, it can be used by breeders to accelerate the introgression of alleles of interest into elite varieties. For the establishment of a gene targeting technique, two strategies based on the use of the I-SceI meganuclease were tested. These approaches involved the use of three elements which are: a target locus containing the cleavage site of I-SceI, a repair template and the sequence encoding I-SceI (or ISceI::GR). The first strategy, consisting of the retransformation of target locus lines with the repair template and I-SceI, does not seem workable because no gene targeting events were isolated. The second strategy, based on the assembly of the three components by crossing, is more promising. Despite the low activity of I-SceI::GR, homologous recombination events were observed in leaf tissues of certain plants. Embryogenic callus, developed from these plants, permitted the regeneration of plants with gene targeting events. This work opens new perspectives in the development of controlled GMO production.