Die idiopathische Lungenfibrose ist eine seltene Form der interstitiellen Lungenerkrankung mit variablem Krankheitsverlauf und schlechter Prognose. Diese Arbeit untersucht den Effekt einer Kombinationstherapie aus Immunsuppressiva (Azathioprin / Cyclophosphamid) und Corticosteroiden auf den Verlauf der Erkrankung, v. a. im Hinblick auf eine mögliche Stabilisierung der Lungenfunktion. / Idiopathic pulmonary fibrosis is a rare and special form of interstitial lung disease. The natural history is variable and there are limited treatment options. Therefore we ask, if it is possible to stabilize lung function by treatment with azathioprine / cyclophosphamid in combination with corticosteroids.

Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a progressive parenchymal lung disease with limited therapeutic treatments. Pathologically altered lung fibroblasts, called myofibroblasts, exhibit increased proliferation, migration, and collagen production, and drive IPF development and progression. Fibrogenic factors such as Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) contribute to these pathological alterations. Endogenous counter-regulating factors are barely known. Published studies have described a protective role of exogenously administered C-type Natriuretic Peptide (CNP) in pathological tissue remodeling, for example in heart and liver fibrosis. CNP and its cyclic GMP producing guanylyl cyclase B (GC-B) receptor are expressed in the lungs, but it is unknown whether CNP can attenuate lung fibrosis by this pathway. To address this question, we performed studies in primary cultured lung fibroblasts. To examine the effects of the CNP/GC-B pathway on PDGF-BB-induced collagen production, proliferation, and migration in vitro, lung fibroblasts were cultured from wildtype control and GC-B knockout mice. Human lung fibroblasts from patients with IPF and healthy controls were obtained from the UGMLC Biobank. In RIA experiments, CNP, at 10nM and 100nM, markedly and similarly increased cGMP levels in both the murine and human lung fibroblasts, demonstrating GC-B/cGMP signaling. CNP reduced PDGF-BB induced proliferation and migration of lung fibroblasts in BrdU incorporation and gap closure assays, respectively. CNP strongly decreased PDGF-BB-induced collagen 1/3 expression as measured by immunocytochemistry and immunoblotting. Importantly, the protective actions of CNP were preserved in IPF fibroblasts. It is known that the profibrotic actions of PDGF-BB are partly mediated by phosphorylation and nuclear export of Forkhead Box O3 (FoxO3), a transcription factor downregulated in IPF. CNP prevented PDGF-BB elicited FoxO3 phosphorylation and nuclear exclusion in both murine and human control and IPF fibroblasts. CNP signaling and functions were abolished in GC-B-deficient lung fibroblasts. Taken together, the results show that CNP moderates the PDGF-BB-induced activation and differentiation of human and murine lung fibroblasts to myofibroblasts. This effect is mediated CNP-dependent by GC-B/cGMP signaling and FoxO3 regulation. To follow up the patho-physiological relevance of these results, we are generating mice with fibroblast-restricted GC-B deletion for studies in the model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. / Idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) ist eine progressiv fortschreitende, parenchymale Lungenerkrankung mit beschränkten therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten. Pathologisch veränderte Lungenfibroblasten, sogenannte Myofibroblasten, zeigen eine verstärkte Proliferation, Migration und Kollagenproduktion, die zu einem permanenten Fortschreiten der Erkrankung führen. Während fibrogene Faktoren wie Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) zu dieser pathologischen Veränderung beitragen, sind endogene Faktoren, die diesem Wandel entgegenwirken, kaum bekannt. Allerdings konnten Studien bereits eine protektive Wirkung von exogen verabreichten C-typ natriuretischen Peptid (CNP) auf krankhaft verändertes Gewebe beschreiben, wie beispielsweise bei Herz- und Leberfibrose. Es ist bekannt, dass CNP und sein cGMP produzierender Rezeptor Guanylyl-Cyclase-B Rezeptor (GC-B) in der Lunge exprimiert werden. Allerdings konnte noch nicht nachgewiesen werden, ob CNP durch diesen Signalweg den Fortschritt einer Lungenfibrose verzögern kann. Um dies herauszufinden, wurden Experimente mit kultivierten, primären Lungenfibroblasten durchgeführt. Um die Effekte des CNP/ GC-B Signalwegs auf die PDGF-BB induzierte Kollagenproduktion, Proliferation und Migration in vitro zu überprüfen, wurden Lungenfibroblasten von Kontroll- und GC-B-Knock-Out Mäusen kultiviert. Weiterhin erhielten wir von der UGMLC Biobank menschliche Fibroblasten von IPF-erkrankten Patienten, sowie gesunde Kontrollfibroblasten. Zur Bestätigung der Funktionalität des GC-B/cGMP Weges, wurde in murinen und humanen Fibroblasten mithilfe eines RIAs ein durch CNP (10nM und 100nM) deutlich erhöhtes cGMP-Level gemessen. CNP reduzierte die durch PDGF-BB induzierte Beschleunigung von Proliferation und Migration der Lungenfibroblasten, was mit Hilfe von BrdU incorporation und Gap closure assay nachgewiesen wurde. Ebenfalls zeigten Immunocytochemistrie und -blotting, dass CNP den PDGF-BB induzierten Anstieg an Kollagenexpression verhindert. Somit wurde festgestellt, dass der schützende Effekt von CNP auch in IPF Fibroblasten erhalten bleibt. Weiterhin ist bekannt, dass die PDGF-BB-induzierten, profibrotischen Veränderungen durch Phosphorylierung und Export des Transkriptionsfaktors Forkhead Box O3 (FoxO3) aus dem Zellkern vermittelt werden, welcher in IPF Fibroblasten vermindert exprimiert ist. CNP verhindert diese PDGF-BB aktivierte Phosphorylierung und Translokation in murinen und humanen Kontroll- und IPF-Fibroblasten. In Lungenfibroblasten mit Deletion des GC-B- Rezeptors war das CNP-Signal und auch dessen Effekt ausgelöscht. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass CNP die PDGF-BB induzierte Aktivierung und Differenzierung von menschlichen und murinen Lungenfibroblasten zu Myofibroblasten beeinflusst. Dieser Effekt wird CNP-abhängig durch den GC-B/cGMP Signalweg und durch die Regulierung von FoxO3 vermittelt. Um abschließend die pathophysiologische Relevanz dieser Erkenntnisse zu zeigen, werden zukünftig Mäuse mit einer fibroblasten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors für Studien in Bleomycin-induzierter Lungenfibrose genutzt.

Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a progressive lung disease characterized by altered lung fibroblasts known as myofibroblasts. These myofibroblasts play a crucial role in the development and progression of IPF by exhibiting increased proliferation, migration, and collagen production. One of the fibrogenic factors implicated in these pathological changes is Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB). However, there is limited knowledge about endogenous factors that counteract these fibrotic processes. Previous research has shown that exogenously administered C-type Natriuretic Peptide (CNP) has a beneficial impact on tissue remodeling, specifically in conditions like heart and liver fibrosis. While CNP and its receptor, guanylyl cyclase B (GC-B), are expressed in the lungs, it remains unknown whether CNP can mitigate lung fibrosis through this pathway. To address this question, we first established murine pulmonary fibroblast isolation and culture and investigated whether PDGF-BB-induces any profibrotic changes in vitro. PDGF-BB stimulation led to an increase in the intracellular levels of the profibrotic proteins Collagen, type I, alpha 1 (Col1a1), Collagen, type III, alpha 1 (Col3a1) and Matrix metalloproteinase 9 (MMP9) indicating transition towards a fibrotic phenotype. Exogenous synthetic CNP at 10 nM and 100 nM could significantly attenuate the PDGF-BB-induced increase in intracellular Col1a1 and Col3a1 levels. CNP increased intracellular cGMP levels in cultured lung fibroblasts, indicating a presence of GC-B-dependent signaling pathway. Even in the presence of pre-existing high PDGF-BB levels, CNP was able to activate GC-B, thus triggering the intracellular signaling cascade. Furthermore, we could confirm, that PDGF-BB acts via activation of the MAPK cascade and PI3K/Akt/mTOR pathway, leading to phosphorylation and nuclear exclusion of forkhead box protein O3 (FoxO3), a transcription factor associated with the progression and severity of multiple diseases, including pulmonary fibrosis. This inactivation of FoxO3 could be attenuated by pretreatment with CNP. Furthermore, stimulation with CNP significantly increased the phosphorylation of VASP at serine 239, unaffected by PDGF-BB, suggesting that CNP mediates its attenuation of PDGF-BB-induced FoxO3 inactivation and decrease of collagen expression via activation of protein kinase G (PKG) I. Thus, in summary, CNP inhibits PDGF-BB-induced Col1a1 and Col3a1 expression which might me mediated by maintenance of FoxO3 activation. / Idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine fortschreitende Lungenerkrankung, die durch veränderte Lungengewebszellen, sogenannte Myofibroblasten, gekennzeichnet ist. Diese Myofibroblasten spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der IPF, indem sie eine erhöhte Proliferation, Zellmigration und Kollagenproduktion zeigen. Einer der fibrogenen Faktoren, die an diesen pathologischen Veränderungen beteiligt sind, ist Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB). Es ist jedoch wenig darüber bekannt, welche endogenen Faktoren diesen fibrotischen Prozessen entgegenwirken. Frühere Forschungsarbeiten haben allerdings gezeigt, dass exogen verabreichtes C-Typ natriuretischem Peptid (CNP) eine schützende Wirkung auf den Gewebeumbau hat, insbesondere bei Erkrankungen wie Herz- und Leberfibrose. Obwohl CNP und sein Rezeptor Guanylylzyklase B (GC-B) in der Lunge exprimiert werden, ist noch unbekannt, ob CNP durch diesen Signalweg die Lungenfibrose mildern kann. Um diese Frage zu beantworten, isolierten und kultivierten wir zunächst murine Lungenfibroblasten und untersuchten, ob PDGF-BB in vitro profibrotische Veränderungen hervorruft. Die Stimulierung mit PDGF-BB führte zu einem Anstieg der intrazellulären Spiegel der profibrotischen Proteine Kollagen Typ I, alpha 1 (Col1a1), Kollagen Typ III, alpha 1 (Col3a1) und Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9), was auf eine Transformation zu einem fibrotischen Phänotyp hin. Exogen zugeführtes synthetisches CNP von 10 nM und 100 nM konnte den durch PDGF-BB verursachten Anstieg der intrazellulären Col1a1- und Col3a1-Spiegel signifikant abschwächen. CNP erhöhte den intrazellulären cGMP-Spiegel in kultivierten Lungenfibroblasten, was auf einen GC-B-abhängigen Signalweg hinweist. Selbst in Gegenwart hoher PDGF-BB-Spiegel konnte CNP seinen Rezeptor GC-B aktivieren und somit die intrazelluläre Signalkaskade auslösen. Darüber hinaus konnten wir bestätigen, dass PDGF-BB über die Aktivierung der MAPK-Kaskade und des PI3K/Akt/mTOR-Signalwegs wirkt, was zur Phosphorylierung und Ausschluss von Forkhead-Box-Protein O3 (FoxO3) aus dem Nukleus führt, eines Transkriptionsfaktors, der mit dem Fortschreiten und der Schwere zahlreicher Krankheiten, einschließlich pulmonaler Fibrose, in Verbindung gebracht wird. Diese Inaktivierung von FoxO3 konnte durch Vorbehandlung mit CNP abgeschwächt werden. Des Weiteren erhöhte die Stimulation mit CNP signifikant die Phosphorylierung von VASP an Serin 239 unbeeinflusst von PDGF-BB. Dies legt nahe, dass CNP seine Abschwächung der PDGF-BB-induzierten Inaktivierung von FoxO3 und Verringerung der Kollagenexpression über die Aktivierung von Proteinkinase G (PKG) I vermittelt. Zusammenfassend hemmt CNP die PDGF-BB-induzierte Expression von Col1a1 und Col3a1, was durch die Aufrechterhaltung der FoxO3-Aktivierung vermittelt werden könnte.