La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une maladie myéloproliférative, résultant d'une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22, donnant naissance à une kinase de fusion à activité continue, la BCR-ABL. Les inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITK) sont le traitement de choix de la LMC, mais ces inhibiteurs n'offrent pas de cure radicale aux patients, qui, une fois le traitement interrompu, présentent une rechute et une exacerbation de leur condition. En plus, les patients peuvent développer une résistance ou une intolérance aux ITK, d'où la nécessité de nouvelles modalités thérapeutiques. Les imidazoquinoxalines sont de nouveaux composés à visée anticancéreuse, dont la structure est basée sur celle de l'imiquimod, un immunomodulateur connu. EAPB0203, un composé du groupe des imidazo[1,2-α]quinoxalines, a fait preuve d'un pouvoir anticancéreux sur des cellules de mélanome, in vitro et in vivo, ainsi que sur des cellules de leucémie liée au virus HTLV-1, in vitro. EAPB0503 est un composé de la même famille, à pouvoir environ 10 fois supérieur à celui de l'EAPB0203 sur les cellules de mélanome. Dans le cadre de ce projet de thèse, l'activité de l'EAPB0203 a été comparée à celle de l'EAPB0503, et leur effet sur la prolifération de trois lignées cellulaires de LMC a confirmé que l'EAPB0503 est plus efficace que l'EAPB0203. Pour ce, l'EAPB0503 a été adopté pour la suite des expérimentations que nous avons entreprises dans le but de caractériser le mécanisme d'action par lequel ce composé inhibe la croissance cellulaire. Les CI50 de l'EAPB0503 ont été déterminées pour chacune des trois lignées, et adoptées tout au long du travail. On a démontré que l'EAPB0503 provoque un arrêt du cycle cellulaire en PréG0 (accumulation de cellules apoptotiques) et en G2/M. Une nette augmentation du niveau de phosphorylation de l'histone-3 suggère un arrêt des cellules en début de mitose. Cet arrêt du cycle cellulaire s'accompagne d'une diminution du potentiel membranaire mitochondrial, d'une activation modérée du cytochrome c et du clivage de PARP (suggérant l'implication de caspases). On a également démontré que l'EAPB0503 induit l'apoptose comme le montre la fragmentation de l'ADN. Des résultats préliminaires proposent aussi une stabilisation de la protéine pro-apoptotique, bax, et une diminution du niveau de la protéine anti-apoptotique Bcl-2, augmentant ainsi le rapport Bax/Bcl-2 et renversant ainsi l'équilibre du côté apoptotique. En plus, EAPB0503 a potentialisé l'effet de l'imatinib (le premier ITK), et, à deux, ces deux agents ont eu un effet synergique sur la croissance des cellules de LMC. Il a été également très intéressant de montrer que l'EAPB0503 dégrade l'oncoprotéine, BCR-ABL, dans les cellules sensibles et résistantes à l'imatinib. Ensemble, ces résultats suggèrent un effet prometteur de l'EAPB0503 sur la LMC, en monothérapie ou en association avec les ITK. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder that originates in a reciprocal translocation, resulting in the Philadelphia chromosome that harbors the bcr-abl oncogene. This fusion gene codes for a constitutively active tyrosine kinase, BCR-ABL that confers leukemogenesis. Tyrosine kinase inhibitor (TKI), have revolutionized the therapeutic management of CML. Imatinib, the first generation TKI, is highly effective in inducing remissions and prolonging the survival of CML patients. However, failure of this therapy occurs in almost one-third of the patients due to intolerance to treatment, lack of therapeutic response or resistance. Moreover, CML stem cells (LIC) remain insensitive to this therapy, which almost inevitably leads to relapse upon treatment discontinuation. Imidazoquinoxalines are imiquimod derivatives with direct immunomodulatory effect and antitumor activity on melanoma and T-cell lymphoma, attributed to growth inhibition and induction of caspase-dependent apoptosis. We investigated the effects of EAPB0203 and EAPB0503, novel imidazoquinoxaline derivatives, on human CML cell lines. We show that EAPB0203 and EAPB0503 inhibit cell growth of three CML cell lines in a dose- and time-dependent manner. Compared to the previously described EAPB0203, EAPB0503 has a better inhibitory activity on CML cells. We demonstrated that EAPB0503 induced a specific cell cycle arrest in mitosis in CML cells, evidenced by decreased levels of cyclin D1 and increased phosphorylation of histone-3. This was accompanied by the direct activation of apoptosis as demonstrated by increased PreG0 population, DNA breakage, poly(ADP-ribose) polymerase cleavage and breakdown of mitochondrial membrane potential. Preliminary results have shown a stabilization of the pro-apoptotic molecule, bax, versus a decrease in anti-apoptotic bcl-2, shifting the ratio towards the induction of apoptosis. Interestingly, EAPB0503-treated cells had decreased levels of BCR-ABL oncoprotein. The combination of EAPB0503 with imatinib synergizes to inhibit CML cells proliferation and most importantly, EABP0503 inhibited the proliferation of imatinib-resistant CML cells offering a promising therapeutic modality that alone or in combination with TKI would circumvent mutations and resistance to TKI and improve the prognosis of CML.

Le projet concerne des molécules hétérocycliques, de faible poids moléculaire, présentant des activités cytotoxiques comparables à celles des meilleurs anticancéreux actuellement sur le marché. Ces molécules sont originales, protégées par un brevet international et un brevet de sélection déposé en décembre 2014. La synthèse des premières molécules leaders est maîtrisée et l’exemplification de la diversité moléculaire est en cours. Les études menées pour définir leur profil d’activité permettent d’identifier des caractéristiques tout à fait originales. Le projet, en phase de développement préclinique académique, a permis l’identification de composés leaders présentant des potentiels de développement en tant qu’anticancéreux. Le mécanisme exact des molécules développées est encore en cours d’étude et permettra de définir s’il s’agit d’un mode d’action unique ou multiple. Plusieurs têtes de séries ont pu être identifiées avec visiblement des modes d’actions différents. En effet, les composés EAPB0203 et EAPB0503 montrent un effet dose à partir de 1 µM sur la polymérisation de la tubuline mais la molécule EAPB02303, la plus active sur la lignée A375 (CI50 = 10 nM, de dix fois à cent fois plus active que les deux précédentes), ne montre aucune fixation à la tubuline à la dose de 1µM suggérant un mécanisme d’action différent et original. Le sujet de recherche présenté concerne le développement des études précliniques de ces molécules à visée anticancéreuse. Le premier axe de travail a été de mettre au point une formulation galénique de l'EAPB0503 sous forme de nanocapsules lipidiques. Afin d’optimiser la biodisponibilité des composés, sans perdre leur activité intrinsèque, nous avons ensuite réalisé une modulation chimique sur la structure la plus active des Imiqualines : l’EAPB02303. Afin d’améliorer la balance globale hydrophilie/lipophilie (HLB) des composés dérivés de l’EAPB02303, nous avons greffé un résidu acide aminé en position 4. Enfin, la mise au point d’une méthode de dosage de l’EAPB02303 et l’EAPB02302 en milieu plasmatique en vue d’une étude pharmacocinétique a été le dernier axe du travail de thèse. / The project relates to heterocyclic molecules, low molecular weight, having cytotoxic activities similar to those presented by the best anticancer agents currently on the market. These molecules are originals, protected by an international patent and a selection patent filed in December 2014. The synthesis of the first molecules leader is under control and the exemplification of molecular diversity is underway. Studies to define their activity profile allow to identify quite original features. The project, in its academic preclinical development phase, enabled the identification of leader’s compounds with potential for development as anticancer. The exact mechanism of the molecules developed is still under study and will determine whether there is a single or multiple mode of action. Several series leads were identified with apparently different modes of action. Indeed, compounds EAPB0203 and EAPB0503 show a dose effect from 1 µM on tubulin polymerization but compound EAPB02303, the more active on A375 cell line (IC50 = 10 nM, ten times to hundred times more active than the preceding two), shows no binding to tubulin at a dose of 1 µM suggesting a different and original mechanism of action. The research topic presented concerns the preclinical development of these anticancer molecules. The first line of work was to develop a galenic formulation of EAPB0503 in the form of lipid nanocapsules. To optimize the bioavailability of the compounds, without losing their intrinsic activity, we achieved chemical modulation on the most active structure Imiqualines: EAPB02303. To improve the overall balance hydrophilic / lipophilic (HLB) of compounds derived from EAPB02303, we considered grafting amino acids on position 4. Finally, the development of a method for assaying EAPB02303 and EAPB02302 in plasma for a pharmacokinetic study has been the final focus of the thesis work.

Les imidazoquinoxalines (imiqualines), molécules bioactives originales analogues chimiques de l’imiquimod et présentant un important potentiel anticancéreux, ont été explorées afin d’élucider leurs mécanismes d'action. Les molécules EAPB0203 et EAPB0503, identifiées lors d’études antérieures comme étant les « têtes de séries », ont montré un effet cytotoxique puissant in vitro sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines de mélanome et de lymphomes T. Nous avons étudié l’effet cytotoxique de 13 imiqualines nouvellement synthétisées sur une lignée cellulaire de mélanome humain (A375). Tous les composés ont montré un effet cytotoxique important. L’effet cytotoxique a été démontré sur d’autres lignées cellulaires cancéreuses humaines (côlon, sein et lymphome T de l’adulte).Un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M a été mis en évidence par cytométrie en flux sur des cellules A375 traitées par EAPB0203 et EAPB0503. Cet arrêt du cycle cellulaire semble être en relation avec un effet inhibiteur de la polymérisation de la tubuline. En effet, nos résultats ont montré que l’EAPB0503 et 3 autres imiqualines inhibent la polymérisation de la tubuline. L’étude de modélisation moléculaire de la liaison à de la tubuline a montré que ces composés se fixent sur le site de la colchicine.Une analyse transcriptomique sur EAPB0503 a été effectuée pour élucider le mécanisme d'action des imiqualines. Cette étude a été faite sur la lignée A375 en comparaison avec 13 anticancéreux de référence. L’étude transcriptomique a montré que EAPB0503 a une composante antitubuline tout en révélant un mécanisme d’action original. Deux hypothèses mécanistiques pour EAPB0503 ont ainsi été identifiées : 1/ altération de la voie de signalisation liée aux intégrines, 2/ altération de la voie de signalisation du récepteur TNFR et de FasL.Des analyses fonctionnelles in vitro nous ont permis d’explorer ces hypothèses. Ainsi, une altération uniquement des voies de signalisation PI3K/AKT et RAS/MAPK, toutes deux liées aux intégrines, a été observée. La première hypothèse semble donc validée. De plus, ce résultat a été confirmé par l’étude de l’expression et de la phosphorylation de ERK.Finalement, nous avons développé une formulation injectable par voie intraveineuse de EAPB0503 à base de nanocapsules. Cette formulation a d’abord été testée in vitro et in vivo sur un modèle de lymphome. Ces études ont pu mettre en évidence l’absence de toxicité des nanoparticules vides et le maintien de l’activité cytotoxique de EAPB0503 encapsulé in vitro, avec un effet immunomodulateur in vivo qui demande à être exploré. / The imidazoquinoxalines (imiqualines), original bioactive molecules and chemical analogues of imiquimod and with significant anti-cancer potential, were explored in order to elucidate their mechanisms of action. The molecules EAPB0203 and EAPB0503 identified in previous studies as leader, showed potent in vitro cytotoxic effect on human cancer cell lines of melanoma and T lymphoma. We studied the cytotoxic effect 13 newly synthesized imiqualines on a cell line of human melanoma (A375). All compounds showed a significant cytotoxic effect. The cytotoxic effect was shown on other human cancer cell lines (colon, breast and adult T lymphoma).A cell cycle block in G2 / M phase was demonstrated by flow cytometry on A375 cells treated with EAPB0203 and EAPB0503. This cell cycle arrest seems to be related with an inhibitory effect on the polymerization of tubulin. Indeed, our results showed that EAPB0503 and three other imiqualines inhibit tubulin polymerization. The molecular modeling study of binding to tubulin showed that these compounds bind at the colchicine site.A transcriptomic analysis on EAPB0503 was performed to elucidate the mechanism of action of imiqualines. This study was made on the A375 line compared with 13 approuved anticancer molecules. This transcriptomic study showed that EAPB0503 has an antitubulin effect while revealing a novel mechanism of action. Two mechanistic hypotheses for EAPB0503 were identified: 1/ alteration of the signaling pathway linked to integrin, 2/ alteration of the signaling pathway TNFR receptor and FasL.In vitro functional analyses have allowed us to explore these hypotheses. Thus, alteration only PI3K / AKT and RAS / MAPK signaling pathways, both related to integrins, was observed. The first hypothesis seems confirmed. Moreover, this result was confirmed by the study of the expression and phosphorylation of ERK.Finally, we developed an intravenously injectable formulation of EAPB0503 based on nanocapsules. This formulation was first tested in vitro and in vivo on lymphoma model. These studies could highlight the lack of toxicity of empty nanoparticles and retention of the cytotoxic activity of encapsulated EAPB0503 in vitro, with an in vivo immunomodulatory effect which needs to be explored.