Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Eingeschränkte Apoptose trägt zur Tumorentstehung und zur Entwicklung von Chemoresistenz bei, da die Apoptose normalerweise Zellen mit genetischen Schäden oder malignem Potential eliminiert. Dieser Prozess, der bereits für viele unterschiedlichen Tumorzellen nachgewiesen wurde, limitiert häufig die Behandelbarkeit maligner Erkrankungen und ist somit ein grosses Problem in der heutigen Krebsbehandlung. Es existieren unterschiedliche Ansätze die Auslöseschwelle für die Apoptose zu vermindern, um so Chemotherapie-resistente Tumorzellen zu eliminieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das anti-tumorale Potential des bispezifischen 4625 Antisense-Oligonukleotid in Kombination mit chemotherapeutischen Wirkstoffen in vitro und in vivo untersucht. Der zweite Teil beschreibt die Ergebnisse mit dem rekombinanten Ep-CAM spezifischen scFv Immunotoxin 4D5MOC-B-ETA in vitro und im Modell der Nacktmaus. Bcl-2 und Bcl-xL sind Inhibitoren der Apoptose, die von vielen malignen Tumorzellen überexprimiert werden. Das Herunterregulieren von Bcl-2 oder Bcl-xL erniedrigt die apoptotische Auslöseschwelle und Tumorzellen sterben durch programmierten Zelltod. Das 4625 Antisense Oligonukleotid richtet sich gegen eine Region hoher Homologie in der bcl-2/bcl-xL mRNA und hemmt simultan die Expression von Bcl-2 und Bcl-xL. Die durch das bispezifische 4625 Antisense gehemmte Expression von Bcl-2 und Bcl-xL in Tumorzellen unterschiedlicher Histologie zeigen die Ergebnisse der Immuno-Blots. Weiterhin führt 4625 zur dosisabhängigen Wachstumshemmung von Krebszellen bei Konzentrationen von 75-600 nM im MTT Assay. Für die Kombinationsbehandlung wurden Paclitaxel und 5-FU jeweils als Standardtherapie zur Behandlung von Brust- und kolorektalem Karzinom gewählt. Die ip. Applikation von 20mg/kg KG 4625 mit oder ohne Paclitaxel/5-FU führte zu einem verlangsamten Wachstum humaner Tumor Xenotransplantaten in Nacktmäusen, im Vergleich mit denen die mit dem Kontrolloligonukleotid 4626 mit oder ohne Chemotherapie behandelt wurden. Bcl-2 und Bcl-xL spielen unterschiedliche Rollen in der Tumorentwicklung und sind häufig heterogen in soliden Tumorgeweben exprimiert. Diese Daten zeigen, daß die moderne Antisense Technologie eine wirksame Methode zur Herunterregulierung zweier Hauptinhibitoren der Apoptose mit einem einzigen Oligonukleotid darstellt, wovon möglicherweise mehr Patienten mit malignen Erkrankungen in Zukunft profitieren könnten. Die Expression bestimmter Zelloberflächenmoleküle ist ein häufiger Prozess in vielen soliden Tumoren, was sie für eine zielgerichtete Antikörpertherapie angreifbar macht. Das epitheliale Glykoprotein-2 (Ep-CAM) wird reichlich von epithelialen Tumoren und Tumorzellinien exprimiert. Die antineoplastische Aktivität des Ep-CAM spezifischen 4D5MOC-B-ETA Immunotoxin wird im zweiten Teil dieser Arbeit beschrieben. In vitro hemmt 4D5MOC-B-ETA spezifisch die Proteinsynthese in Ep-CAM positiven Krebszellen unterschiedlichen histologischen Ursprungs ermittelt durch [H3]leucin Aufnahme und reduzierte die Überlebensrate dieser Zellen in Konzentrationen von 0.01 bis 1 pM. Ep-CAM negative Zellen wurden als negative Kontrolle genutzt und blieben durch das Immunotoxin in Konzentration bis zu 10.000 pM unversehrt, was dessen hochgradige Ep-CAM Spezifität beweist. Die tägliche Applikation von 0.01 mg 4D5MOC-B-ETA im Nacktmausmodell führte zu einem Schrumpfen der Tumor Xenotransplantate während der Behandlungszeit. Diese hohe Wirksamkeit des scFv Immunotoxin bedarf weiterer Beachtung in der zukünftigen Krebstherapie. / Impaired apoptosis contributes to cancer development and resistance towards chemotherapy, since apoptosis normally eliminates cells with damaged DNA or increased malignant potential. The increased resistance towards cell death often limits therapeutic options in the clinic and is one major problemin current tumor therapy. Different approaches, which have been described so far intend to lower the apoptotic threshold in order to eliminate chemoresistant cancer cells. In the first part of this thesis the anti-tumor potential of the bispecific 4625 oligonucleotide was investigated in combination with chemotherapeutic drugs in vitro and in vivo. The second part describes the anti tumor activity of the recombinant Ep-CAM specific scFv immunotoxin 4D5MOC-B-ETA in vitro and in nude mice. Bcl-2 and Bcl-xL are inhibitors of apoptosis frequently overexpressed in malignant tumor cells. Downregulation of either Bcl-2 or Bcl-xL lowers the apoptotic threshold and tumor cells undergo apoptosis. The 4625 antisense oligonucleotide targets a region of high homology shared by the bcl-2/bcl-xL mRNAs and simultaneously downregulates Bcl-2 and Bcl-xL. The 4625 bispecific Antisense Oligonucleotide downregulates Bcl-2 and Bcl-xL expression in cancer cell lines of diverse histological origins assessed by immuno blotting. It further leads to proliferation inhibition of cancer cells at concentrations ranging from 75-600 nM in MTT assay in a dose-dependent manner. For combination experiments Paclitaxel and 5-FU were chosen as standard therapy for the treatment of breast and colorectal cancer, respectively. The ip. application of 20 mg/kg 4625 with or without Paclitaxel/5-FU led to a growth inhibition of established human carcinomas xenografts in nude mice, relative to those treated with the 4626 control oligonucleotide with or without chemotherapy. Bcl-2 and Bcl-xL play nonredundant roles in tumor growth and are often heterogeneously expressed in solid tumor tissues. This data suggests that state-of-the-art antisense technology offers a potent approach to inhibit the expression of the two major anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL with one single oligonucleotide, which could make additional patients benefit from a treatment with this antisense compound. Expression of certain cell surface antigens is a common process in many solid tumors making them suitable for targeted antibody therapy. The epithelial glycoprotein-2 (Ep-CAM) is abundantly expressed on carcinomas and cancer cell lines. The anti tumor activity of the Ep-CAM specific 4D5MOC-B-ETA immunotoxin is described in the second part. In vitro 4D5MOC-B-ETA specifically inhibited protein synthesis in Ep-CAM positive cancer cells of diverse histological origin assessed by [H3]leucin incorporation and reduced cell viability with IC50 ranging from 0.01 to 1 pM. Ep-CAM negative cells were taken as control and were not harmed by the immunotoxin at concentrations up to 10.000 pM, which proves the 4D5MOC-B-ETA Ep-CAM specific potential. In athymic mice, the systemic application of 4D5MOC-B-ETA at a dose of 0.01 mg per day resulted in the regression of established tumor xenografts during the time of treatment. This highly potent anti-tumor activity of a recombinant scFv immunotxin deserves further attention for use in cancer therapy.