Orientador: Eleni Gomes / Banca: Cristiane Sanchez Farinas / Banca: George Jackson Moraes Rocha / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: João Cláudio Thoméo / Resumo: A adsorção não-produtiva das celulases e β-glicosidases à lignina tem sido consideradaum fator limitante da hidrólise do material lignocelulósico. Esse trabalho avaliou ainteração entre celulases e β-glicosidases dos coquetéis comerciais de Trichodermareesei (Cellic Ctec2) e Aspergillus niger (Novo 188) com preparações de ligninaisoladas por hidrólise enzimática (LDHE) e hidrólise ácida (LDHA) do bagaço de canapré-tratado hidrotermicamente. Também foi selecionada uma β-glicosidase tolerante àinibição pela glicose a partir da coleção de fungos de trabalho do Laboratório deBioquímica e Microbiologia Ibilce/Unesp e o efeito da LDHE e dos compostosfenólicos derivados do pré-tratamento hidrotérmico sobre a mesma foram avaliados. ALDHA apresentou maior capacidade de adsorção das enzimas do que LDHE. A 45°Ctodas as enzimas de T. reesei se ligaram a LDHE e a LDHA. As atividades residuais deendoglucanase, β-glicosidase e exoglucanase no sobrenante após a incubação com aLDHE foi de 28, 45 e 63%. Exoglucanase e β-glicosidase foram completamenteadsorvidas a LDHA enquanto que a endoglucanase manteve 14% da atividade. A β-glicosidase de A.niger foi menos afetada mantendo 94 e 48% da atividade na presençade LDHE e LDHA. A β-glicosidase de A. niger purificada apresentou 89 e apenas 2%de atividade no sobrenadante quando incubada com LDHE e LDHA, contra 100 e 95%de atividade da enzima presente no coquetel. A diminuição da temperatura para 30°Cprovocou a... / Abstract: Non-productive adsorption of cellulase and beta-glucosidase enzymes onto lignin isshown to be a limiting factor to enzymatic hydrolysis of lignocellulosic. This studyevaluated the interaction of cellulases and beta-glucosidase from Trichoderma reesei(Cellic Ctec2) and Aspergillus niger (Novo 188) commercial cocktail with ligninpreparations isolated from liquid hot water sugarcane bagasse by enzymatic (LDHE)and acid hydrolysis (LDHA). Furthermore, a glucose tolerant β-glucosidase wasselected from the collection of working fungi of Laboratório de Bioquímica eMicrobiologia (Ibilce/Unesp), effect of LDHE and liquid hot water pretreatment-derivedphenolic compounds were evaluated. LDHA had higher adsorption capacity on enzymesthan LDHE. At 45°C T. reesei enzymes bound to both LDHE and LDHA.Endoglucanase, beta-glucosidase and exoglucanase remained activities in thesupernatant after incubation with LDHE were 28, 45 e 63%. Exoglucanase and betaglucosidasewere completely adsorbed onto LDHA while endoglucanase activityremained in the supernatant was 14%. A. niger beta-glucosidase was less adsorptionthan enzymes from T. reesei, it maintained 94 and 48% of the activity in the presence ofLDHA and LDHE. Purified beta-glucosidase from A. niger showed 89 and only 2%activity in the supernatant after incubation with LDHE LDHA, while beta-glucosidasefrom enzymatic cocktail showed 100 and 95% of the enzyme activity. The decrease oftemperature to 30°C decreased ... / Doutor

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Banca: Mario Tyago Murakami / Banca: Gustavo O. Bonilla Rodriguez / Banca: Aliandra Maura Gibertoni Malaman / Resumo: Os microrganismos termofilicos são de grande interesse biotecnológico, não apenas por tolerar altas temperaturas, mas também por secretarem proteínas de maior estabilidade, com características bioquímicas e estruturais importantes de múltiplas aplicações na indústria. A linhagem do fungo termofílico Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolada de camas de frango, apresentou alta atividade da enzima β-1,4-endoglucanase (31 U/ml). O gene codificante da β-1,4-endoglucanase de F.2.1.4 foi identificado e expresso em leveduras Pichia pastoris e em bactéria Escherichia coli. A caracterização do gene permitiu identificar esta enzima como membro da família glicosídeo hidrolase 5 (GH5), nomeada neste estudo como Mh_GH5. A enzima apresenta na região N-terminal um módulo de ligação ao substrato (CBM) pertencente a família 1. As enzimas expressas em P. pastoris e em E. coli foram purificadas e submetidas à caracterização bioquímica. A caracterização bioquímica demonstrou que as enzimas recombinantes apresentaram ótimos de temperatura de 55°C (P. pastoris) e 60°C (E. coli) e pH ótimo de 4,0 para ambos os sistemas heterólogos. A análise da estabilidade das enzimas demonstrou que as enzimas expressas por Pichia pastoris apresentaram-se estáveis em temperaturas mais elevadas (70°C), indicando que a glicosilação teria papel essencial na termoestabilidade de enzimas recombinantes. A determinação estrutural em alta resolução foi realizada para o domínio catalítico desta nova β-1,4-endoglucanase GH5 de M. heterothallica expressa em E. coli. A estrutura foi determinada à 1.1 Å e apresenta uma arquitetura frequentemente encontrada dentre os membros da família de GH5, (β/α)8 TIMbarrel. Os dados obtidos neste estudo podem contribuir para a determinação de características envolvidas na termoestabilidade de enzimas provenientes de... / Abstract: Thermophilic microorganisms have gain attention in the last years because of the biotechnological interest. Essentially these organisms secrete thermostable proteins displaying suitable features, such as biochemical and structural, for industrial platforms. The thermophilic fungus Myceliophthora heterothallica F.2.1.4, isolated from poultry litter, showed high activity for β-1,4- endoglucanase (31 U/ml). A new sequence enconding for glycoside hydrolase was identified and expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli. Sequence analysis allowed to classify this new β-1,4-endoglucanase as a member of the glycoside hydrolase 5 (GH5). The enzyme, named Mh_GH5, has N-terminal family 1 carbohydrate binding module (CBM1). The recombinant enzymes expressed in Pichia pastoris and Escherichia coli were purified and subjected to biochemical characterization. Recombinant endoglucanases showed optimal temperature of 55°C (P. pastoris) and 60°C (E. coli) and optimal pH of 4,0 for both heterologous systems. The thermostability of these new enzymes were evaluated and demonstrated that post-translational modifications, such as glycosylation, found on Pichia pastoris heterologous enzymes, contributed to higher thermostability. Structural analysis of the catalytic domain of the new GH5 from M. heterothallica expressed in E. coli was solved at 1.1 Å resolution and shows a common (β/α)8 TIM-barrel fold found in members of GH5 family. Based on the biochemical and structural information we have obtained for Mh_GH5 it is possible to suggest potential features involved in the thermostability of proteins from thermophilic microorganisms and might contribute for the development of new efficient biocatalysts required for biomass conversion to bioethanol and/or ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-22Bitstream added on 2014-06-13T20:35:41Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_an_me_sjrp.pdf: 651485 bytes, checksum: f6bb7160fc2afa8aae9c65f75fff26da (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Há um grande interesse no mercado de enzimas para descobertas de novas fontes para prospecção, tendo em vista que as enzimas de origem animal ou vegetal não suprem totalmente a demanda mundial. Desta forma busca-se não apenas novas fontes, mas também materiais fermentescíveis de baixo custo, assim agregando valor ao produto final. Neste trabalho investigou-se a produção de peptidase utilizando o fungo Aspergillus flavus, através de dois processos biofermentativos, sólido e submerso, usando farelo de trigo e meio complexo, respectivamente. Alguns parâmetros foram analisados para a obtenção de uma melhor produção. Para o bioprocesso fermentativo sólido foi investigado a influência da concentração de esporos, suplementação do meio com fontes adicionais de nitrogênio, temperatura e tempo. Obtivemos para essas variações a melhores condições quando o fungo era fermentado somente em farelo de trigo, sem suplementação de fontes adicionais de nitrogênio, com a proporção de 2,5x 10 6 esporos/ 5g meio a 30°C e em 96 horas de fermentação. Para o bioprocesso fermentativo submerso avaliamos a influência da concentração de esporos, suplementação do meio com fontes de carbono e com caseína, temperatura, pH e tempo. Obtivemos como melhores condições quando o fungo era fermentado em meio sem suplementação de fonte de carbono adicional, com 0,5% de caseína, 5x10 5 esporos/mL de meio a 30°C em pH 8 por 168 horas. Os extratos enzimáticos de ambos bioprocessos foram caracterizados bioquimicamente avaliando desta forma: pH ótimo, temperatura ótima e classe da peptidase. A partir desses dados foram realizados métodos cromatográficos para obtenção da peptidase pura e com essa amostra realizou-se a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos... / There is a great interest by enzyme’s market on discovery of new sources for prospecting, considering that the enzymes from animal or plant do not fully supply the global demand. Therefore, the research of new sources, is not only of new sources, but also fermentable material with low cost are also required, in order to add value to the final product. In this study it was investigated the production of peptidase using the fungus Aspergillus flavus, through two processes, solid and submerged fermentation, using wheat bran and complex media, respectively. Some parameters were analyzed to obtain the best production. In solid fermentation bioprocess were investigated the influence of spore concentration of supplementation of the medium with additional sources of nitrogen, temperature and time. We obtained for these variations the best conditions when the fungus was fermented wheat bran only, without supplementation of additional sources of nitrogen, with a density of 2.5 x 10 6 spores / 5 g medium at 30 ° C and 96 hours of fermentation. In the submerged fermentation bioprocess were evaluated the effect of spore concentration supplementation of the medium with carbon sources and with casein, temperature, pH and time. We obtained as best conditions when the fungus was fermented in medium without supplemental carbon source added with 0.5% casein, 5x10 5 spores / ml medium at 30°C at pH 8 for 168 hours. The enzymatic extracts obtained by these bioprocesses were biochemically characterized by testing optimum pH, optimum temperature and class of peptidase. From these data it was obtained a pure peptidase by using chromatographic methods and this sample was used for functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters, using the peptide substrate of FRET. The fungus Aspergillus flavus... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-28Bitstream added on 2014-06-13T20:50:19Z : No. of bitstreams: 1 carneiro_aaj_me_sjrp.pdf: 580507 bytes, checksum: 4c1dad8d17aa4960b07b2f4da681cd4c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é uma enzima microbiana que converte o amido em ciclodextrinas (CDs). Estes compostos são moléculas cíclicas, formadas por monômeros de D-glicoses unidas por ligações glicosídicas do tipo a-1,4. As CDs podem ser uma alternativa para controlar o escurecimento de batatas e frutas devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão com substratos da reação de escurecimento. Alimentos contendo amido, quando adicionados da CGTase são também, potencialmente capazes de sofrer a ação da enzima formando CD localmente. Esse trabalho teve por finalidade estudar a aplicação direta da enzima CGTase em batatas e a aplicação de ciclodextrina comercial em batatas, maçãs, bananas e pêras visando controlar as reações de escurecimento enzimático ou não enzimático, destes alimentos. A formação de complexos com ciclodextrina foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Este trabalho mostrou pela primeira vez que tanto a CGTase produzida por Bacillus clausii E16 quanto a CGTase comercial (Toruzyme., Novozymes), foram capazes de controlar o escurecimento químico de batata e enzimático de batata e maçã. A utilização da CD mostrou efeito similar a ação das CGTases para batata e maçã, reduzindo dessa forma o escurecimento enzimático causado pela enzima polifenoloxidase. Pode-se inferir que ocorreu a produção da CD pela ação da CGTase em presença do substrato natural (amido de batata e maçã) e por conseqüência sua ação complexante junto aos agentes responsáveis pelo escurecimento, inibindo assim a efetivação das reações. Essa possível encapsulação foi demonstrada pela análise de DSC referente à diminuição do pico da amostra de batata tratada com CGTase. / The cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a microbial enzyme that converts starch to cyclodextrins (CDs). These compounds are cyclical molecules, formed by D-glucose monomers linked by a-1,4-glycosidic linkages type. The CDs can be an alternative to control the potato and fruits browning due its capacity to form complexes of inclusion with substrate of the browning reaction. Foods containing starch, when added of the CGTase are also potentially able to the action from the enzyme, then forming CD. This work had the purpose to study the direct application of the CGTase enzyme in potatoes and the commercial cyclodextrin application in potatoes, apples, bananas and pears aiming to control the browning enzymatic or no enzymatic reactions of these foods. The cyclodextrin complexes formation was determined by differential scanning calorimetry (DSC). This work showed for the first time that as the CGTase produced for Bacillus clausii E16 as the commercial CGTase (Toruzyme., Novozymes), were capable to control the chemical browning of potato and enzymatic browning of potato and apple. The use of the CD showed to similar effect to the action of CGTases for potato and apple, reducing in both the enzymatic browning caused by polyphenoloxidase enzyme. It can be concluded that the production of CD occurred by CGTase action in presence of the natural substrate (starch of potato and apple) and for consequence it s action to form complexes next to the responsible agents for the browning, thus inhibiting effectively the reactions. This possible encapsulation was demonstrated by analysis of DSC referring to the reduction of the peak of the potato sample treated with CGTase.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T18:52:38Z : No. of bitstreams: 1 grajalesagudelo_lm_me_sjrp.pdf: 1125266 bytes, checksum: 0a1704ff26652dd0ebc35a9e7da2243a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O objetivo geral deste trabalho foi contribuir no projeto de um biorreator rotativo para aplicação de Fermentação em Estado Sólido (FES), visando à produção do fungo entomopatogênico M. anisopliae, empregando arroz como substrato. O desenvolvimento do projeto foi realizado em duas etapas. A primeira etapa consistiu em visualizar a homogeneidade e a movimentação de partículas de arroz, em um protótipo construído em acrílico. Isto, com o objetivo de avaliar as melhores configurações dos componentes internos do reator. O método empregado na análise de homogeneidade foi a técnica de traçadores coloridos, utilizando uma concentração de 10% em massa de arroz tingido de preto e 90% de arroz branco. A concentração da mistura foi determinada de duas maneiras: (i) manualmente, por separação e pesagem das amostras e, (ii) por análise de imagem mediante o software Lenseye (E&CS Programs). Além disso, foram determinadas as velocidades das partículas em três regiões do leito: na superfície, centro do leito e do lado da parede do cilindro, e foram estabelecidos os regimes de escoamento e os graus de enchimento trabalhados. As variáveis estudadas foram massa total de arroz (5, 10 e 15 Kg), velocidade de rotação (1, 4 e 7 RPM) e a presença e ausência de tubos simuladores de alimentação dentro do tambor. Posteriormente, no mesmo equipamento, foi analisada a molhabilidade do leito, por determinação da umidade em três pontos do leito, na seção longitudinal do tambor. O material particulado empregado nestes experimentos foram esferas de sílica gel de 6mm de diâmetro. As variáveis avaliadas foram quantidade de água aspergida (0,1 e 0,05 mL/g material), vazão de água (1600, 2000 e 2400 mL/min) e carga total de material (5,8 e 12,6 Kg). A segunda etapa consistiu em analisar o comportamento térmico do reator, empregando o equipamento construído em aço... / This work is aimed to contribute to the development of a rotary drum bioreactor for Metarhiziun anisopliae spore production by Solid State Fermentation, using rice as a substrate. This work is comprised of two parts, one corresponding to particle moving analysis and another on thermal aspects. The first part assesses both the mixture and the movement of particles of rice in a Plexiglas rotary drum, in order to identify the optimal operational conditions for the best particle mixture. Tracer method was applied to assess the particle mixture and two techniques were applied to assess the mixture: manual sampling and image analysis using Lenseye (E&CS Programs) software. The flow regime and particle velocities were also identified by filming the bed while rotating. For particle measurements three regions were analyzed: wall, core and surface. Rice load (5, 10, and 15 kg), rotation velocity (1, 4, and 7 RPM), and the presence or absence of inner tubes within the bed were the independent variables for all the tests. Afterwards, the bed wetability was analyzed in the same equipment, using 6mm diameter silica gel particles. Water was sprinkled over the particles in three axial positions. The selected variables were the volume of water by the bed mass ratio (0,1 and 0,05 mL/g), the water flow rate (1600, 2000, and 2400 mL/min), and the particle load (5,8, and 12,6 kg). The second part assessed the thermal behavior of a glass beads bed, 3mm diameter, in a stainless steel rotary drum. The main purpose of this step was to identify the optimal operational conditions for the best thermal homogeneity. The selected variables were the air flow rate, the bed load, and the rotational conditions (static or mobile). From the first part, the results showed that a complete mixture was obtained after 5, 9, and 11 drum revolutions for 5, 10, and 15 kg loads, respectively, independently from the tracer... (Complete abstract click electronic access below)

O crescimento nas atividades agroindustriais e industriais torna eminente o problema referente à destinação de resíduos gerados nestas atividades. Atualmente, a maior parte dos resíduos gerados são destinados para aterros de resíduos industriais e, no caso de estercos suínos para esterqueiras devido a viabilidade ambiental e econômica. No entanto, a digestão anaeróbia (DA) é uma solução para o tratamento de resíduos, sendo ambiental e economicamente viável, pois através de microrganismos realiza a conversão de subprodutos indesejados em energia renovável na forma de biogás. O presente trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e identificar microrganismos capazes de auxiliar na conversão de resíduos agrícolas e industriais em biogás. Os resíduos de arroz, couro, esterco suíno (R) e (A), lodo de ETE de curtume e lodo de ETE UCS foram caracterizados através da determinação de concentração de carbono orgânico, teor de sólidos totais antes e após os ensaios de degradação. A adição de inóculos de microrganismos isolados a partir das amostras que geraram maior volume de biogás foram avaliados, entretanto apresentaram baixa fração molar de metano. Assim, realizou-se novo isolamento de microrganismos provenientes de amostras do lodo de ETE da UCS que durante o processo de DA apresentou fração molar de 76% de metano. Foram realizados isolamentos sucessivos dos microrganismos presentes no lodo, o primeiro isolamento foi após 24h de ensaio e posteriormente foi realizado o isolamento a cada 7 dias totalizando 5 isolamentos. Os microrganismos isolados foram identificados como Bacillus toyonensys e B. thurigiensis e foram adicionados em amostras que continham resíduo de esterco (A) e (R), resíduo de couro pré-tratado quimicamente e termicamente, resíduo de arroz e resíduo de arroz com lodo de ETE de curtume. Verificou-se que a adição de inóculos aumentou a fração molar de metano dos resíduos de esterco (A) em (55%), esterco (R) de 0,4 para 0,7. A amostra de arroz e lodo de ETE de curtume gerou uma fração molar de hidrogênio de aproximadamente (1,0). Assim, conclui-se que a presença de microrganismos no processo de DA é fundamental para o aumento da fração molar do gás de interesse, visto que estes produzem enzimas capazes de degradar resíduos e transformá-los em energia na forma de biogás. O efetivo processo de DA é caracterizado pela redução dos teores de carbono, o resíduo de arroz com adição de lodo de ETE de curtume e adição de inóculo apresentou maior redução no teor de carbono (77,88%) e no teor de sólidos totais (90,34%). / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-08-12T17:17:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jayna Pessuto Silva.pdf: 1101519 bytes, checksum: 2649885ff2a5c1e5c105d160347b1367 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-08-12T17:17:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Jayna Pessuto Silva.pdf: 1101519 bytes, checksum: 2649885ff2a5c1e5c105d160347b1367 (MD5) / The growth in agro-industrial and industrial activities becomes imminent problem concerning the disposal of waste generated in these activities. Currently, most of the waste generated is intended for industrial waste landfills and in the case of pig manure to esterqueiras due to environmental and economic viability. However, anaerobic digestion (AD) is a solution for treating waste being environmentally and economically feasible for the treatment of waste, as by microorganisms performs conversion of unwanted by-products in renewable energy. This study aimed to isolate, select and identify microorganisms capable of assisting in the conversion of agricultural and industrial waste into biogas. Rice residues, leather, pig manure (R) and (A), tannery sludge ETE and ETE UCS sludge were characterized by determination of organic carbon, total solids content before and after the degradation tests. The addition of an inoculum of microorganisms isolated from samples of larger volume of biogas generated were evaluated, however showed low molar fraction of methane. Thus, there was re-isolation of microorganisms from WWTP sludge samples during the UCS process showed 76% mole fraction of methane and 73,3mL accumulated volume of biogas. Successive isolation of microorganisms were performed in the mud, the first isolation was after 24 hours test with later isolation every 7 days a total of 5 isolates. The microorganisms were added to samples containing manure residue (A) and (R) pre-treated leather residues chemically and thermally, rice and rice residue with tannery waste sludge WWTP. It has been found that the addition of inoculum increased the mole fraction of methane from manure waste (A) (55%), manure (R) of 0.4 to 0.7. The sample of rice and tannery WWTP sludge generated a mole fraction of hydrogen approximately (1.0). Thus, it is concluded that the presence of microorganisms in the process is essential to the increase of the molar fraction of the gas of interest, since these produce enzymes capable of degrading wastes and convert them into energy in the form of biogas. The actual process of AD is characterized by the reduction of carbon, rice residue with addition of WWTP sludge tanning and adding inoculum greater reduction in carbon content (77.88%) and total solids content (90.34%).

Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fernando Carlos Pagnocca / Banca: Sandra Regtina Ceccato Antonini / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Resumo: O comportamento fisiológico de um determinado microrganismo pode se mostrar diferente frente às variações das condições de cultivo. Em processos biotecnológicos, esse conhecimento permite definir os parâmetros fermentativos a serem controlados de modo a se otimizar custos e rendimento. Neste trabalho, foi padronizado um teste de avaliação da produção de etanol por leveduras a partir de xilose, utilizando placas de Petri, o qual permitiu o reconhecimento de 17 leveduras fermentadoras xilose. Dessas cepas, quando em fermentação em meio líquido, destacaram-se a Candida shehatae, var. shehatae PT1- 1BASP, que produziu 12 g.L-1 de etanol e Aureobasidium pullulans LB3.1, com 7 g.L-1. A produção de etanol por essas duas cepas foi avaliada com relação à parâmetros fermentativos, como tolerância a compostos reconhecidos como inibidores do crescimento de leveduras, temperatura de incubação, pH inicial do mosto, concentração do inóculo e adição de nutrientes minerais. A definição das melhores condições de fermentação elevou o consumo de xilose por ambas as cepas, ao mesmo tempo que diminui a produção de biomassa e aumentou o rendimento em etanol por A. pullulans LB3.1. As linhagens C. shehatae PT1-1BASP e A. pullulans LB3.1 atingiram um máximo de produção de etanol de 18,7 g.L-1 e 17,5 g.L-1, respectivamente. Além dessas duas leveduras, a cepa Brettanomyces bruxellensis ISA 2211, contaminante de vinhos, foi avaliada com relação à tolerância a SO2 diante de variações nas condições de cultivo. A adição de vitaminas e extrato de levedura ao mosto aumentou a resistência da levedura ao dióxido de enxofre, enquanto a presença do etanol, em combinação com o SO2, exerceu maior inibição do crescimento. Foi estudada também nesse trabalho, a capacidade de B. bruxellensis ISA 2211 de utilizar o ácido ρ-cumárico como fonte de carbono, observando-se que o crescimento da levedura nessa condição foi... / Abstract: The microorganisms can show different behavior in different conditions of cultivation. In biotechnological processes, this knowledge allows that fermentation parameters to be controlled in order to optimize costs and yield. In this work it was standardized a test of ethanol production by yeast from xylose using Petri dishes assay, which allowed the recognition of 17 xylose fermenting yeasts. Using submerged fermentation it was detected that Candida shehatae, var. shehatae PT1-1BASP produced 12 g L -1 of ethanol and Aureobasidium pullulans LB3.1, 7 g L-1. Ethanol production by these two strains was evaluated with respect to fermentation parameters, such as tolerance to compounds recognized as inhibitors of growth of yeast, temperature of incubation, initial pH of the must, concentration of the inoculum and nutrient addition. The definition of the best fermentation conditions increased the xylose consumption by both strains, while it decreases the production of biomass and increased ethanol yield by A. pullulans LB3.1. The C. shehatae PT1-1BASP and A. pullulans LB3.1 reached a maximum ethanol yield of 18.7 gL-1 and 17.5 gL-1, respectively. Besides these two yeasts, Brettanomyces bruxellensis the ISA 2211, a wine contaminating strain, was evaluated with respect to SO2 tolerance in the face of variations in culture conditions. The addition of vitamins and yeast extract to must increased the yeast resistance to sulfur dioxide, while the presence of ethanol, in combination with SO2, had greater growth inhibition. It was also studied in this work, the ability of B. bruxellensis ISA 2211 to use the ρ-coumaric acid as a carbon source, noting that the growth of yeast in that condition was dependent on the acid concentration in the medium, not tolerating concentrations high than 5 mmol. L-1 / Doutor

Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli / Resumo: Há um grande interesse no mercado de enzimas para descobertas de novas fontes para prospecção, tendo em vista que as enzimas de origem animal ou vegetal não suprem totalmente a demanda mundial. Desta forma busca-se não apenas novas fontes, mas também materiais fermentescíveis de baixo custo, assim agregando valor ao produto final. Neste trabalho investigou-se a produção de peptidase utilizando o fungo Aspergillus flavus, através de dois processos biofermentativos, sólido e submerso, usando farelo de trigo e meio complexo, respectivamente. Alguns parâmetros foram analisados para a obtenção de uma melhor produção. Para o bioprocesso fermentativo sólido foi investigado a influência da concentração de esporos, suplementação do meio com fontes adicionais de nitrogênio, temperatura e tempo. Obtivemos para essas variações a melhores condições quando o fungo era fermentado somente em farelo de trigo, sem suplementação de fontes adicionais de nitrogênio, com a proporção de 2,5x 10 6 esporos/ 5g meio a 30°C e em 96 horas de fermentação. Para o bioprocesso fermentativo submerso avaliamos a influência da concentração de esporos, suplementação do meio com fontes de carbono e com caseína, temperatura, pH e tempo. Obtivemos como melhores condições quando o fungo era fermentado em meio sem suplementação de fonte de carbono adicional, com 0,5% de caseína, 5x10 5 esporos/mL de meio a 30°C em pH 8 por 168 horas. Os extratos enzimáticos de ambos bioprocessos foram caracterizados bioquimicamente avaliando desta forma: pH ótimo, temperatura ótima e classe da peptidase. A partir desses dados foram realizados métodos cromatográficos para obtenção da peptidase pura e com essa amostra realizou-se a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There is a great interest by enzyme's market on discovery of new sources for prospecting, considering that the enzymes from animal or plant do not fully supply the global demand. Therefore, the research of new sources, is not only of new sources, but also fermentable material with low cost are also required, in order to add value to the final product. In this study it was investigated the production of peptidase using the fungus Aspergillus flavus, through two processes, solid and submerged fermentation, using wheat bran and complex media, respectively. Some parameters were analyzed to obtain the best production. In solid fermentation bioprocess were investigated the influence of spore concentration of supplementation of the medium with additional sources of nitrogen, temperature and time. We obtained for these variations the best conditions when the fungus was fermented wheat bran only, without supplementation of additional sources of nitrogen, with a density of 2.5 x 10 6 spores / 5 g medium at 30 ° C and 96 hours of fermentation. In the submerged fermentation bioprocess were evaluated the effect of spore concentration supplementation of the medium with carbon sources and with casein, temperature, pH and time. We obtained as best conditions when the fungus was fermented in medium without supplemental carbon source added with 0.5% casein, 5x10 5 spores / ml medium at 30°C at pH 8 for 168 hours. The enzymatic extracts obtained by these bioprocesses were biochemically characterized by testing optimum pH, optimum temperature and class of peptidase. From these data it was obtained a pure peptidase by using chromatographic methods and this sample was used for functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters, using the peptide substrate of FRET. The fungus Aspergillus flavus... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Hamilton Cabral / Banca: Eleni Gomes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Fernanda Canduri / Banca: Wagner Alves de Souza Júdice / Resumo: Aspártico (E.C. 3.4.23), cisteíno (E.C. 3.4.22) e serino peptidases (E.C. 3.4.21) são endopeptidases, cujos modos de ação são dependentes de resíduos de ácido aspártico, cisteína e serina presentes no sítio catalítico, respectivamente. Atualmente, vários estudos são realizados na busca por novas enzimas com relevantes propriedades bioquímicas para aplicação industrial. Neste contexto, nós propomos a produção de enzimas em bioprocesso submerso, purificação, estudo das propriedades bioquímicas e determinação da especificidade catalítica das peptidases secretadas pelos fungos filamentosos Rhizomucor miehei, Phanerochaete chrysosporium e Leptosphaeria sp. Inicialmente, após produção por bioprocesso submerso, estas enzimas foram purificadas utilizando cromatografias de exclusão molecular e troca iônica. Em ensaios de inibidores na atividade enzimática, notamos inibição das peptidases por pepstatina A (R. miehei), ácido iodoacético/N-Etilmaleimida (P. chrysosporium) e fluoreto de fenil metil sulfonila (Leptosphaeria sp), sendo então definidas como aspártico, cisteíno e serino peptidases, respectivamente. Por SDS-PAGE (12%), as massas moleculares foram estimadas em 37 kDa (aspártico), 23 kDa (cisteíno) e 35 kDa (serino). O máximo de atividade proteolítica foi alcançado em pH 5,5 e 55 ºC para peptidase aspártica secretada por R. miehei; pH 7 e faixa de temperatura 45-55 ºC para cisteíno peptidase secretada por P. chrysosporium, e pH 7 e 45 ºC para serino peptidase secretada por Leptosphaeria sp. Sob efeito de incubação a diferentes pH, a peptidase aspártica mostrou-se estável em condições ácidas (pH 3-5); cisteíno peptidase foi estável em ampla faixa de pH (pH 4-9), e serino peptidase mostrou-se mais estável em condições com tendências alcalinas e pH ligeiramente ácido (pH 5-9). Em todas estas faixas de pH citadas, as peptidases apresentaram atividade proteolítica acima de 80% por 1 hora... / Abstract: Aspartic (EC 3.4.23), cysteine (EC 3.4.22) and serine peptidases (EC 3.4.21) are endopeptidases whose modes of action are dependent on aspartic acid, cysteine and serine residues present in the catalytic site, respectively. Currently, several studies are conducted in the search for new enzymes with relevant biochemical properties for industrial application. In this context, we propose the production of enzymes in submerged bioprocess, purification, the study of biochemical properties and determining the catalytic specificity peptidases secreted by the filamentous fungus Rhizomucor miehei, Phanerochaete chrysosporium and Leptosphaeria sp. Initially, after production submerged bioprocess, these enzymes have been purified using size-exclusion and ion exchange chromatographies. In the effect of inhibitors on enzyme activity, we note peptidase inhibition by pepstatin A (R. miehei), iodoacetic acid/ N-Ethylmaleimide (P. chrysosporium) and phenyl methyl sulfonyl fluoride (Leptosphaeria sp), suggesting that these enzymes are aspartic, cysteine and serine peptidases, respectively. For SDS-PAGE (12%), molecular weights were estimated at 37 kDa (aspartic), 23 kDa (cysteine) and 35 kDa (serine). Maximum proteolytic activity was achieved at pH 5.5 and 55 °C for aspartic peptidase secreted by R. miehei; pH 7 and temperature range 45-55 °C for cysteine peptidase secreted by P. chrysosporium and pH 7 and 45 °C for serine peptidase secreted by Leptosphaeria sp. Under incubation at different pH effect, aspartic peptidase was stable under acidic conditions (pH 3-5); cysteine peptidase was stable in wide pH range (pH 4-9), and serine peptidase was more stable under alkaline conditions and pH slightly acidic (pH 5-9). In all these pH ranges mentioned, peptidases showed proteolytic activity above 80% by 1 hour incubation. As regards the thermal stability, cysteine peptidase was more thermostable enzyme and serine peptidase described the lowest temperature ... / Doutor

O crescimento nas atividades agroindustriais e industriais torna eminente o problema referente à destinação de resíduos gerados nestas atividades. Atualmente, a maior parte dos resíduos gerados são destinados para aterros de resíduos industriais e, no caso de estercos suínos para esterqueiras devido a viabilidade ambiental e econômica. No entanto, a digestão anaeróbia (DA) é uma solução para o tratamento de resíduos, sendo ambiental e economicamente viável, pois através de microrganismos realiza a conversão de subprodutos indesejados em energia renovável na forma de biogás. O presente trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e identificar microrganismos capazes de auxiliar na conversão de resíduos agrícolas e industriais em biogás. Os resíduos de arroz, couro, esterco suíno (R) e (A), lodo de ETE de curtume e lodo de ETE UCS foram caracterizados através da determinação de concentração de carbono orgânico, teor de sólidos totais antes e após os ensaios de degradação. A adição de inóculos de microrganismos isolados a partir das amostras que geraram maior volume de biogás foram avaliados, entretanto apresentaram baixa fração molar de metano. Assim, realizou-se novo isolamento de microrganismos provenientes de amostras do lodo de ETE da UCS que durante o processo de DA apresentou fração molar de 76% de metano. Foram realizados isolamentos sucessivos dos microrganismos presentes no lodo, o primeiro isolamento foi após 24h de ensaio e posteriormente foi realizado o isolamento a cada 7 dias totalizando 5 isolamentos. Os microrganismos isolados foram identificados como Bacillus toyonensys e B. thurigiensis e foram adicionados em amostras que continham resíduo de esterco (A) e (R), resíduo de couro pré-tratado quimicamente e termicamente, resíduo de arroz e resíduo de arroz com lodo de ETE de curtume. Verificou-se que a adição de inóculos aumentou a fração molar de metano dos resíduos de esterco (A) em (55%), esterco (R) de 0,4 para 0,7. A amostra de arroz e lodo de ETE de curtume gerou uma fração molar de hidrogênio de aproximadamente (1,0). Assim, conclui-se que a presença de microrganismos no processo de DA é fundamental para o aumento da fração molar do gás de interesse, visto que estes produzem enzimas capazes de degradar resíduos e transformá-los em energia na forma de biogás. O efetivo processo de DA é caracterizado pela redução dos teores de carbono, o resíduo de arroz com adição de lodo de ETE de curtume e adição de inóculo apresentou maior redução no teor de carbono (77,88%) e no teor de sólidos totais (90,34%). / The growth in agro-industrial and industrial activities becomes imminent problem concerning the disposal of waste generated in these activities. Currently, most of the waste generated is intended for industrial waste landfills and in the case of pig manure to esterqueiras due to environmental and economic viability. However, anaerobic digestion (AD) is a solution for treating waste being environmentally and economically feasible for the treatment of waste, as by microorganisms performs conversion of unwanted by-products in renewable energy. This study aimed to isolate, select and identify microorganisms capable of assisting in the conversion of agricultural and industrial waste into biogas. Rice residues, leather, pig manure (R) and (A), tannery sludge ETE and ETE UCS sludge were characterized by determination of organic carbon, total solids content before and after the degradation tests. The addition of an inoculum of microorganisms isolated from samples of larger volume of biogas generated were evaluated, however showed low molar fraction of methane. Thus, there was re-isolation of microorganisms from WWTP sludge samples during the UCS process showed 76% mole fraction of methane and 73,3mL accumulated volume of biogas. Successive isolation of microorganisms were performed in the mud, the first isolation was after 24 hours test with later isolation every 7 days a total of 5 isolates. The microorganisms were added to samples containing manure residue (A) and (R) pre-treated leather residues chemically and thermally, rice and rice residue with tannery waste sludge WWTP. It has been found that the addition of inoculum increased the mole fraction of methane from manure waste (A) (55%), manure (R) of 0.4 to 0.7. The sample of rice and tannery WWTP sludge generated a mole fraction of hydrogen approximately (1.0). Thus, it is concluded that the presence of microorganisms in the process is essential to the increase of the molar fraction of the gas of interest, since these produce enzymes capable of degrading wastes and convert them into energy in the form of biogas. The actual process of AD is characterized by the reduction of carbon, rice residue with addition of WWTP sludge tanning and adding inoculum greater reduction in carbon content (77.88%) and total solids content (90.34%).