Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:21Z : No. of bitstreams: 1 Publico-178.pdf: 625763 bytes, checksum: bd311a8cd3f7ff010bc833233dd4c82b (MD5) / Objetivo: Desenvolvimento e aplicação de protocolos de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real para a detecção bacteriana e classificação de Gram em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com suspeita clínica de endoftalmite. Métodos: Especificidade analítica foi estabelecida utilizando 31 microrganismos clinicamente importantes, 20 gram-positivos e 11 gram-negativos. Reação cruzada com DNA humano e DNA fúngico foi testada. Amostras controles de humor aquoso coletadas após facoemulsificação foram incluídas. Sensibilidade analítica para as metodologias de PCR foram determinadas utilizando diluição seriada 1:10 de DNA extraído de S. epidermidis e E. coli. As técnicas foram posteriormente aplicadas e testadas em amostras de humor aquoso e vítreo coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de endoftalmite. Preparações comerciais de Taq DNA polimerase foram pré-tratadas com DNaseI. Resultados: Amplificação genérica do gene 16S rDNA foi positiva para todos os isolados bacterianos. Classificação de Gram pela técnica de Nested Multiplex PCR não foi possível apenas para isolados de Acinetobacter spp. Utilizando PCR Multiplex em Tempo Real, todos os isolados foram classificados por Gram, sendo que P. acnes exibiu um padrão misto de amplificação. Limite de detecção da metodologia de Nested Multiplex PCR foi de 1 fg/μl para S. epidermidis e E.coli. A sensibilidade de detecção para S. epidermidis e E. coli utilizando reação para detecção universal bacteriana por PCR em Tempo Real com SYBR Green foi de 100 fg/μl (E = 0,82 e 0,86; r2 = 0,99) e 1 pg/μl utilizando metodologia de PCR Multiplex em Tempo Real com Sondas TaqMan (E = 0,66 e 0,77; r2 = 0,99). A positividade da cultura para detecção bacteriana a partir de amostras de humor aquoso e vítreo foi de 47,6% e pelas metodologias de Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real foi de 100% e 95,2% respectivamente. Entre as amostras negativas por cultura (n=10), a metodologia de Nested Multiplex PCR foi positiva para todas (100%) e PCR em Tempo Real em 90% dos casos (9/10). Entretanto, a proporção de falso-positivos pela metodologia de Nested Multiplex PCR (65,4%) foi superior aos valores obtidos por PCR em Tempo Real (7,7%). A classificação de gram foi obtida em 88,8% dos casos por Nested PCR e 100% por PCR em Tempo Real. A correlação entre a identificação clássica e classificação de Gram molecular foi 63,6% para ambas as técnicas. A identificação pelo sequenciamento dos produtos obtidos por Nested Multiplex PCR e PCR em Tempo Real apresentou correlação de 100% e 88,8%, respectivamente, quando comparada a identificação fenotípica. Conclusões: As metodologias de PCR apresentaram boa correlação quando comparadas com os resultados da cultura e a detecção passou de 47,6% por cultura para 100%, demonstrando serem testes viáveis e mais sensíveis para a caracterização laboratorial de endoftalmite. / Objective: Development and application of Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays for detection and Gram classification of bacteria using aqueous and vitreous humor collected from patients with suspected endophthalmitis. Methods: Analytical specificity was established using 31 clinically important pathogens, 20 gram-positive and 11 gram-negative. Specificity was also tested using human DNA and fungal DNA. Control samples of non-infected aqueous humor collected at the end of phacoemulsification surgery were included. Analytical sensitivity was determined using a 10-fold dilution of S. epidermidis and E. coli DNA. After, methodologies were tested in aqueous and vitreous humor collected from patients with clinical diagnosis of endophthalmitis. Comercial Taq polymersase preparations were DNA decontaminated using DNaseI pretreatment. Results: Universal amplification of 16S rDNA was achieved for all bacterial isolated. Nested Multiplex PCR failed only to determine the Gram status of Acinetobacter spp. Gram classification was achieved for every bacterial isolates using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR, and only a P. acnes isolate showed a mixed signal. Limit of detection using Nested Multiplex PCR was 1 fg/μl for both S. epidermidis and E. coli. Sensitivity for detection of S. epidermidis and E. coli DNA using a SYBR Green 16S rDNA-based universal PCR was 100 fg/μl (E = 0.82 and 0.86; r2 = 0.99) and 1 pg/μl using a Multiplex Gram-Specific TaqMan-based PCR (E = 0.66 and 0.77; r2 = 0.99). Culture was positive in 47.6% of aqueous and vitreous humor analysis. Nested Multiplex PCR and Real Time PCR assays were positive in 100% and 95.2% of these cases, respectively. Among negative culture samples, Nested Multiplex PCR was positive for all (100%) and Real Time PCR assays in 90% of cases (9/10). Gram classification was completed for 88.8% and 100% samples using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR methodologies, respectively. Correlation of 63.6% between microbiological and molecular Gram classification was observed using both molecular assays. 16S rDNA sequence-based identification using Nested Multiplex PCR and Real Time PCR products showed 100% and 88.8% correlation respectively when compared with phenotypic identification. Conclusions: Both PCR methodologies presented good correlation when compared with culture-proven results and bacterial detection was improved from 47.6%% to 100% showing to be feasible tests for laboratorial characterization of bacterial endophthalmitis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações