Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-12-17T19:50:58Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CaracterizaçãoAvaliaçãoAtividades.pdf: 30857020 bytes, checksum: c062ec96efd13b67e7d301b2974f228d (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-01-15T17:19:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CaracterizaçãoAvaliaçãoAtividades.pdf: 30857020 bytes, checksum: c062ec96efd13b67e7d301b2974f228d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-15T17:19:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_CaracterizaçãoAvaliaçãoAtividades.pdf: 30857020 bytes, checksum: c062ec96efd13b67e7d301b2974f228d (MD5) Previous issue date: 2008 / Neste trabalho foi avaliada a participação de ecto-nucleotidases, especialmente da família ENTPDase, na infecção in vitro pelo Trypanosoma cruzi. Foi demonstrado que diferentes cepas/clone apresentam atividade ecto-nucleotídásica diversa, porém, as formas tripomastigotas mantém maior hidrólise de ATP. Adicionalmente, utilizando a cepa Y, que apresentou a maior polaridade entre hidrólise de ATP e ADP, definimos uma cinética de atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina durante a manutenção do ciclo celular (passagens) em células VERO. Nas passagens celulares as formas tripomastigotas apresentaram as maiores atividades ecto-ATPásicas e uma tendência à diminuição da relação de hidrólise ATP/ADP com o aumento do número de passagens. Na terceira passagem poucos parasitos foram capazes de internalizar, originando parasitos de P4, com perfil de hidrólise similar aos parasitos das passagens anteriores. A maioria dos parasitos que não internalizaram se diferenciaram em formas arredondadas do tipo amastigotas e apresentaram uma reduzida razão de hidrólise ATP/ADP, semelhante aos amastigotas derivados de tripomastigotas de P1 e P3. Estes dados sugerem que a diminuição da relação ATPase/ADPase seja um fator que de algum modo impede a internalização dos parasitos, induzindo à sua diferenciação e diminuição da infectividade. O uso dos inibidores de apirases como, Suramina, ARL67156 e GdCl3 levou ao bloqueio parcial da atividade ecto-ATPásica e ecto-ADPásica, nos parasitos vivos e na NTPDase-I recombinante purificada, e foram capazes de inibir a infecção em células VERO até o máximo de 78%. A infectividade in vitro também foi inibida pelo tratamento com antisoro anti-NTPDase-I, entretanto, este não se mostrou capaz de bloquear significativamente a hidrólise de ATP e ADP, sugerindo que esta proteína possa ter outras funções que afetam a infectividade além da regulação da concentração de nucleotídeos extracelulares, como, por exemplo, participação na adesão celular. Nossos dados, de maneira geral, indicam a participação das E-NTPDases e da NTPDase-I no processo infectivo e sugerem fortemente que o bloqueio da sinalização dependente destes parece ser realmente um bom alvo para a quimioterapia e possivelmente para imunização. Assim, a inibição do metabolismo extracelular de nucleotídeos de adenina surge agora efetivamente como um novo alvo para o bloqueio da infecção pelo T. cruzi. ______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: In this work we evaluated the role of ecto-nucleotidases (E-NTPDases) in VERO cells Trypanosoma cruzi infection. It was demonstrated that different strains/clone of T. cruzi shows diverse ecto-nucleotidase activities, although all infective forms trypomastigotes presented higher levels of ATP hydrolysis. In addition, using Y strain, that presented highest polarity in ATP x ADP hydrolysis we performed a continuous in vitro infection of T. cruzi in VERO cells culture and evaluated the ectonucleotidase activities using adenine nucleotides. The results showed clearly that ATP/ADP ratio decreases with increase of the cellular passages. In the 3ª to 4ª passage parasites could not penetrate in VERO cells and differentiated to amastigote-like. Analysis of ecto-nucleotidase activities from infective P4 parasites showed higher ATP hydrolysis and ATPase/ADPase ratio. On the other hand the P4 amastigote-like parasites showed low levels of ATPase activity and lower ATPase/ADPase ratio. These data suggested that lower ATPase/ADPase ratio could be related with the decreasing in infectivity and induction of amastigote-like differentiation. Using apyrase inhibitors (Suramin, GdCl3, ARL67156) we observed significant levels of inhibition of ecto-apyrase activities in live trypomastigotes and in the recombinant purified T. cruzi NTPDase-I. The VERO cells infection using these parasites leaded to the block of in vitro infection achieving the maximum inhibition of 78% with 0.1 mM of Suramin. VERO cells infection were inhibited to when trypomastigotes were treated with anti-apyrase anti-serum (T. cruzi anti NTPDase-I), but this antiserum was not able to inhibit the T. cruzi ecto-apyrase and NTPDase-I activities. These data suggested that the NTPDase-I could have any other function that modulates the penetration of parasites in the host cells, maybe a role in adhesion events. Our data strongly supports the effective participation of E-NTPDases and the NTPDase-I in the T. cruzi in vitro infective processes. Additionally the partial blockage of this enzyme and related signalizations could really be a new good target to chemotherapy and immunization of Chagas Disease. Finishing, the inhibition of extra cellular adenine metabolism is now reveled as a new target to block T. cruzi infection.