Les résultats de la transplantation hépatique (TH) se sont considérablement améliorés mais la survie à long terme est une préoccupation des transplanteurs. Elle dépend de la survenue d’un rejet, de la récidive de l’hépatite C, du traitement immunosuppresseur et de ses complications. Après une TH suite à une complication de l’hépatite C, l'infection du greffon par le virus de l’hépatite C (VHC) est constante, et l'évolution de l'hépatite chronique est plus rapide et agressive que chez les non transplantés. L’implication des cellules T régulatrices (Treg) a été suggérée dans l’induction de tolérance après transplantation et dans la persistance de l’infection par le VHC. Le nombre et la fonction des Treg seraient influencés par le traitement immunosuppresseur (IS). Dans ce contexte, je me suis intéressé au rôle des Treg dans l’évolution de la TH, et les effets des différents traitements utilisés (IS et anti-VHC) sur ces cellules. Les résultats montrent que les Treg, en particulier les cellules régulatrices de type 1 (Tr1), seraient prédictifs de la réponse au traitement antiviral C, et aussi que les Treg pourraient être impliquées dans l’évolution de la récidive virale C après TH. JE montre aussi que les inhibiteurs de mTor induisent une augmentation de taux des Treg chez les patients transplantés hépatiques après changement du traitement d’un anticalcineurine, et que les anticalcinurines réagissent différemment sur l’activité suppressive des Treg in vitro. En conclusion, je précise le rôle majeur des Treg à la fois dans l’évolution de la récidive virale C sur le greffon hépatique, mais également quels sont les IS qui auraient un effet favorable sur le développement des Treg. / The results of liver transplantation (LT) have improved significantly, but long-term graft survival is still a major concern for doctors. It depends on the rejection rates, the recurrence of hepatitis C, and the immunosuppressive treatment and its complications. After LT, the graft reinfection with HCV is constant, and the evolution of chronic hepatitis is faster and more aggressive when compared to the time course before transplantation. It has been suggested the regulatory T cells (Treg) are involved in the induction of tolerance after organ transplantation, and in the persistence of HCV infection by suppressing the HCV-specific T responses. Furthermore, the number and function of Treg are very likely influenced by the immunosuppressive therapy used after transplantation. In this context, my work focuses on the role of Treg cells in the evolution of liver transplantation, and the effects of different treatments used after LT (immunosuppressive and anti-HCV) on this population. The results of my thesis show that the Treg cells (Type-1 regulatory cells, Tr1, in particular) are predictive of the response to the anti-HCV treatment after LT, and that Treg cells are associated with severe evolution of recurrent hepatitis C. I show that mTOR inhibitors have a positive impact on the number of circulating Treg cells in patients who underwent a conversion of therapy from Tacrolimus to a mTOR inhibitor, and that calcinurine inhibitors have different effects on Treg suppressive activity in vitro. In conclusion, we bring evidences on the involvement of Treg cells in HCV recurrence and treatment failure after liver transplantation and in their interaction with immunosuppressive drugs.

La transplantation d'organe est le meilleur traitement en cas de défaillance terminale d'un organe vital. Cependant, la survie sur le long terme est limitée par la perte inexorable de la fonction des greffons. Cette dernière est attribuée à l'inflammation microvasculaire (1MV) causée par la réponse anticorps contre les alloantigènes (rejet humoral chronique (RHC)). En analysant une cohorte de 129 transplantés rénaux présentant de l'1MV sur une biopsie de greffon, nous avons trouvé que, dans la moitié des cas, les lésions n'étaient pas médiées par les anticorps. Chez ces patients, des études génétiques ont révélé une prévalence plus élevée de « mismatches » entre les molécules HLA de classe 1 (HLA-1) du donneur et les « Killer-cell immunoglobulin-receptors » (K1R) inhibiteurs des NK du receveur. Nous avons émis l'hypothèse que la nature allogénique de l'endothélium du greffon pouvait créer un « pseudo-missing-self ». De ce fait, les NK du receveur, exposés à des stimuli inflammatoires, ne reçoivent plus les signaux inhibiteurs transmis par le HLA-1 de la part des cellules endothéliales du donneur. Dans un modèle de co-culture de cellules endothéliales et de NK humains, nous avons démontré que l'absence d'un ligand HLA-1 du soi sur la cellule endothéliale peut activer les NK. Cette activation dépend de la voie mTOR dans les NK, qui peut être bloquée par la rapamycine, un inhibiteur de mTORC1 disponible en clinique. Enfin, nous avons confirmé l'existence de rejets NK induit par le « missing-self » et leur sensibilité à la rapamycine dans un modèle murin de transplantation cardiaque. Notre travail identifie un nouveau type de rejet chronique, exclusivement médié par l'immunité innée, les NK, ayant le même impact délétère sur la survie des greffons que le RHC. Cependant, alors qu'il n'y a pas de traitement disponible pour le RHC, les inhibiteurs de mTOR préviennent efficacement le développement de lésions dans un modèle murin de rejet vasculaire chronique induit par le « missing self » / Organ transplantation is the best treatment for terminal organ failure. However, long-term outcome of organ transplantation remains limited by inexorable loss of graft function, which the prevalent dogma links to the microvascular inflammation (MVI) triggered by the recipient's antibody response against alloantigens (antibody-mediated chronic rejection, AMR). Analysing a cohort of 129 renal transplant patients with MVI on graft biopsy, we found that, in half of the cases, histological lesions were not mediated by antibodies. In these patients, genetic studies revealed a higher prevalence of mismatches between donor HLA-I and inhibitory Killer-cell immunoglobulin-receptors (KIR) of recipient's NK cells. We hypothesized that the allogeneic nature of graft endothelium could create a "pseudo-missing self" situation, thereby the recipient's NK cells exposed to inflammatory stimuli would not receive HLA I-mediated inhibitory signals from donor endothelial cells. In co-culture experiments with human NK cells and endothelial cells, we demonstrated that the lack of self HLA-I on endothelial cells can activate NK. This activation triggers mTOR pathway in NK, which can be blocked by rapamycin, a commercially available inhibitor of mTORC1. Finally, we confirmed the existence of missing self-induced rejection and its sensitivity to mTOR inhibition in a murine heart transplantation model. Our work identifies a new type of chronic rejection, exclusively mediated by innate NK cells, with the same detrimental impact on graft survival as AMR. However, while no therapy is available for AMR, mTOR inhibitors efficiently prevent the development of lesions in murine models of NK cell-mediated chronic vascular rejection

L'endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d'infertilité. Seule l'exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l'endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l'effet n'est que suspensif et transitoire. Il n'existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l'origine de la maladie. L'objectif de notre travail était d'explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d'identifier des molécules capables d'intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l'interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d'endomètre eutopique et d'endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu'un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L'interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l'endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d'essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l'endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale.

L’endométriose concerne 8 à 10% des femmes en âge de procréer et est responsable de douleurs pelviennes chroniques et d’infertilité. Seule l’exérèse chirurgicale des lésions permet un traitement curatif de la maladie. Dans le cas de l’endométriose profonde avec atteinte rectale la chirurgie est extensive et associée à une morbidité significative. Les traitements médicaux reposent sur une hormonothérapie visant à bloquer la fonction ovarienne dont l’effet n’est que suspensif et transitoire. Il n’existe à ce jour aucun traitement ciblant les mécanismes à l’origine de la maladie. L’objectif de notre travail était d’explorer différents mécanismes potentiellement impliqués dans le développement de la maladie et d’identifier des molécules capables d’intervenir sur ces mécanismes. Dans un premier temps nous avons exploré le phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes et cherché un lien avec différentes voies métaboliques impliquées dans la prolifération cellulaire telles que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt. Dans un deuxième temps, nous avons exploré le recrutement des cellules endométriales au sein de la cavité péritonéale au travers de l’interaction CXCR4-CXCL12. Des cultures cellulaires ont été réalisées à partir de prélèvements humains de nodules endométriosiques profonds, d’endomètre eutopique et d’endomètre sain. Des lames histologiques ont été préparées à partir de nodules endométriosiques profonds. Des prélèvements de liquide péritonéal de femmes endométriosiques et de témoins ont été congelés. La prolifération cellulaire a été étudiée par incorporation de thymidine tritiée. La production des FRO a été évaluée par spectrofluorimétrie. La voie ERK a été évaluée par western blot, ELISA et immunohistochimie. La voie Akt été évaluée par western blot et immunohistochimie. Nous avons montré un phénotype hyperprolifératif des cellules endométriosiques profondes en rapport avec une activation de la voie ERK par le biais du stress oxydant et à une activation de la voie Akt. Nous avons montré qu’un anti-oxydant (NAC), un inhibiteur de protéines kinases (A771726), un inhibiteur de Raf (sorafenib), un inhibiteur de mTOR (temsirolimus), un agoniste des cannabinoïdes (WIN 55212-2) et un anti-métabolite (5-FU) pouvaient contôler la prolifération des cellules endométriosiques profondes in vitro et la progression de nodules endométriosiques profonds implantés dans des souris Nudes. L’interaction CXCR4-CXCL12 a été étudiée par western blot, analyse de migration, cytométrie de flux et ELISA. Nous avons montré une attraction spécifique des cellules endométriosiques profondes sur-exprimant le CXCR4 par la chimiokine CXCL12 présente en quantité accrue dans le liquide péritonéal des femmes endométriosiques. En conclusion, nous avons montré que le traitement médical de l’endométriose pouvait être non hormonal et que le stress oxydant, la voie ERK et la voie Akt constituaient de nouvelles pistes thérapeutiques à évaluer dans le cadre d’essais cliniques. Nous avons également montré comment la modification constitutive des cellules de l’endomètre eutopique pouvait favoriser leur recrutement dans la cavité péritonéale. / Endometriosis, a common disease that affects approximately 8 to 10% of women of childbearing age, is responsible for chronic pelvic pain and infertility. There is currently no cure other than surgical removal of lesions. In the case of deep infiltrating endometriosis with rectal involvement, surgery is associated with a significant morbidity. Medical treatments are based on a hormone used to block ovarian function. Their effects are only transient and suspensive. There is currently no treatment targeting the mechanisms underlying the disease. The aim of our study was to explore different pathways potentially involved in the development of endometriosis and to identify molecules that act on these mechanisms. In a first step, we explored the hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells and sought a link with different metabolic pathways involved in cell proliferation such as oxidative stress, ERK, and Akt pathways. In a second step, we explored the recruitment of endometrial cells in the peritoneal cavity through the CXCL12-CXCR4 interaction. Cell cultures were taken from deep infiltrating endometriosis nodules, eutopic endometrium and control endometrium. Histological slides were prepared from deep endometriotic nodules. Peritoneal fluid of women with deep infiltrating endometriosis, and of women without endometriosis were frozen. Cell proliferation was determined by [H3]thymidine incorporation. Cellular production of ROS was assessed by spectrofluorometry. ERK pathway was assessed by Western blot, ELISA assay and immunohistochemistry. The Akt pathway was assessed by Western blot and immunohistochemistry. We showed a hyperproliferative phenotype of deep infiltrating endometriosis cells in line with an activation of the ERK pathway through an up-regulation of oxidative stress, and activation of the Akt pathway. We have shown that an antioxidant (NAC), an inhibitor of protein kinases (A771726), a Raf inhibitor (sorafenib), an inhibitor of mTOR (temsirolimus), a cannabinoid agonist (WIN 55212-2) and an anti-metabolite (5-FU) could control the proliferation of endometriotic cells in vitro, and the growth of endometriotic nodules grafted in Nude mice. The CXCL12-CXCR4 interaction was studied by Western blot, Transwell migration assay, flow cytometry and ELISA assay. We showed a specific attraction of deep infiltrating endometriosis cells over-expressing the CXCR4 chemokine by CXCL12 present in increased amounts in the peritoneal fluid of endometriotic women. In conclusion, we have shown that medical treatment of endometriosis could be non-hormonal and that oxidative stress, ERK and Akt were new therapeutic approaches to assess in clinical trials. We also showed how the molecular changes of eutopic endometrial cells could facilitate their recruitment into the peritoneal cavity.

Positionnée en aval des voies PI3K/AKT et RAS/MAPK, la protéine kinase mTOR joue un rôle déterminant dans le développement et la progression tumorale des cancers colorectaux où elle est fortement surexprimée. Par ailleurs, les cancers colorectaux comme toutes les tumeurs solides, ont un microenvironnement hypoxique. L’adaptation des cellules tumorales à l’hypoxie est notamment régulée par la voie PI3K/AKT/mTOR ainsi que par les facteurs de transcription HIFs dont l’expression protéique et l’activité transcriptionnelle est en partie régulée par mTOR. Dans cette étude, nous avons montré que l’inhibition verticale et complète de l’axe PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α par l’utilisation combinée d’irinotecan à faible dose et d’inhibiteurs catalytiques de mTOR inhibe significativement la prolifération cellulaire de lignées coliques humaines, la croissance tumorale et le développement de métastases de xénogreffes de tumeurs coliques dérivées de patients.En parallèle, une étude de cohorte de tumeurs coliques humaines de stade III par Tissue Micro Array montre que les facteurs HIFs sont fortement exprimés dans l’épithélium et le stroma de cancers du côlon de stade III, qu’une faible expression nucléaire de HIF-1α dans les cellules épithéliales confère une mauvaise survie aux patients et qu’elle a une valeur prédictive de moins bonne réponse au traitement 5-FU. / Downstream of the PI3K/AKT and RAS/MAPK pathways, mTOR protein kinase plays a decisive role in the development and tumor progression of colorectal cancers. Furthermore, the microenvironment of colorectal cancers is hypoxic. The adaptation of the tumor cells to hypoxia is regulated by the PI3K/AKT /mTOR pathway as well as by the HIFs transcription factors whose protein expression and transcriptional activity is partially regulated by mTOR. In this study, we showed that the vertical and complete inhibition of the PI3K / AKT / mTOR /HIF-1α axis by the combined use of low-dose irinotecan and mTOR catalytic inhibitors significantly inhibits human colon cancer cell proliferation, as well as the growth and metastatic development of xenografted human colon tumors. In parallel, a Tissue Micro Array study on a cohort of stage III human colic tumors shows that the HIFs are strongly expressed in the epithelium and stroma of the tumors and a low nuclear expression of HIF-1α in epithelial cells provides with poor survival to patients and has a predictive value of worse response to 5-FU treatment.

Les néoplasmes neuroendocrines gastro-entéro-pancréatiques (NNE GEP) représentent un groupe de tumeurs rares se développant à partir des cellules neuroendocrines de l'organisme. L'arsenal thérapeutique disponible aujourd'hui pour les NNE GEP reste faible, même s'il s'est étoffé au cours de ces dix dernières années avec l'arrivée des thérapies ciblées (inhibiteurs de mTOR et de tyrosine-kinase). Cependant, ces traitements présentent des résistances qui conditionnent leur efficacité et aucun biomarqueur permettant de sélectionner les patients répondeurs à ces traitements ou d'anticiper le développement de résistances n'est connu. Identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et comprendre les mécanismes de résistance est donc un enjeu dans le traitement des NNE GEP. Nos travaux montrent que les cellules de NNE GEP soumises à l'hypoxie ou la déplétion en glucose activent l'Unfolded Protein Response (UPR) et que la voie PERK favorise la survie cellulaire. De plus, la modulation de la réponse UPR (via des inhibiteurs ou inducteurs de l'UPR) diminue la croissance tumorale dans un modèle murin de dissémination métastatique de NNE GEP. Nous avons également découvert qu'un inhibiteur de mTOR, la rapamycine, permet d'activer préférentiellement la voie PERK de l'UPR, favorisant la survie des cellules traitées par la rapamycine. Ces résultats montrent l'intérêt de cibler la réponse UPR dans le traitement des NNE GEP. De plus, nous suggérons la mise en place d'un mécanisme de résistance aux inhibiteurs de mTOR impliquant la voie PERK. Si ces résultats se confirment in vivo et ex vivo, l'association d'un inhibiteur de mTOR et d'un inhibiteur de PERK pourrait palier aux phénomènes de résistance rencontrés avec les inhibiteurs de mTOR dans les NNE GEP / Gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms (GEP NEN) are defined as rare neoplastic lesions developing from neuroendocrine cells. Therapeutic options available for GEP NEN are scarce, although targeted therapies such as mTOR or tyrosine-kinase inhibitors provide new opportunities. However, tumor cells develop resistances to these treatments, which reduce their effectiveness. To date, no biomarker is available to select patients responding to these treatments or to anticipate the development of resistances. Identifying new therapeutic targets and understanding mechanisms of resistance are therefore a relevant issue in the treatment of GEP NEN.We found that GEP NEN cells induce the Unfolded Protein Response (UPR) when subjected to hypoxia or glucose depletion, and that PERK pathway promotes cell survival. Modulation of the UPR thanks to UPR inhibitors or inducers decreases tumor growth in a murine model of metastatic dissemination of GEP NEN. Moreover, the mTOR inhibitor rapamycin preferentially induces PERK arm of the UPR, thereby promoting survival of rapamycin-treated cells. These results show the interest in targeting the UPR in the treatment of NNE GEP. In addition, we here suggest a new resistance mechanism to mTOR inhibitors involving PERK pathway. If these results are confirmed in vivo and ex vivo, the combination of mTOR inhibitor and PERK inhibitor could overcome mTOR inhibitors resistances in GEP NEN