Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-15T18:25:22Z No. of bitstreams: 1 vitor_e_vidal_ioc_bcm_0021_2010.pdf: 5115263 bytes, checksum: fa627a814efc2aa5bda7207fe780c399 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T18:25:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vitor_e_vidal_ioc_bcm_0021_2010.pdf: 5115263 bytes, checksum: fa627a814efc2aa5bda7207fe780c399 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / As calpaínas constituem uma família de cisteína-peptidases neutras dependentes de cálcio presentes numa ampla variedade de organismos. Em virtude da relevância fisiológica dessa proteases, inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos para o tratamento de doenças humanas e microbianas. Estudos recentes vêm relatando a presença de diversas proteínas relacionadas às calpaínas em tripanossomatídeos, mas pouco se sabe a respeito das funções específicas dessas proteínas nesses micro-organismos. Nesse contexto, uma vez que os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da doença de Chagas apresentam sérios efeitos colaterais e podem ser ineficazes, inibidores proteolíticos poderiam ser uma alternativa no tratamento desta doença. Portanto, o presente trabalho investiga a presença de moléculas similares às calpaínas no Trypanosoma cruzi e o efeito inibidor do inibidor III de calpaínas (MDL28170) sobre a proliferação, viabilidade, diferenciação, ultraestrutura e interação das diferentes formas do parasito com células hospedeiras em ensaios in vitro. Nossos resultados revelam a reatividade cruzada de anticorpos produzidos contra calpaínas já bem caracterizadas de Drosophila melanogaster, Homarus americanus e. Trypanosoma brucei contra moléculas de superfície do T. cruzi, conforme demonstrado por imunofluorescência e citometria de fluxo. Em ensaios de Western Blotting foi possível observar que o anticorpo anti-DM-calpaína foi capaz de reagir contra uma proteína de 80 kDa. Pesquisas realizadas no GenBank demonstraram a presença de 4 seqüências nomólogas à calpaína de D. melanogaster no genoma do T. cruzi. Essas 4 seqüências foram identificadas como cisteína-paptidases de massa molecular predita em torno de 80kDa. Nos ensaios de inibição com o MDL28170 foi possível observar a redução da proliferação das formas epimastigotas ao longo de 5 dias de cultura; e a redução significativa da viabilidade das formas tripomastigotas sanguíneas dos parasitos tratados com 25 µM do composto. O inibidor, adicionado nas concentrações de 6,25 à 25 µM, também foi capaz de diminuir de forma dose- e tempo-dependente o número de macrófagos parasitados e o número de parasitas interiorizados nos ensaios de interação com macrófagos peritoneais murinos. O MDL28170 em concentração a partir de 12,5 µM teve ainda um efeito inibitório significativo sobre a adesão de formas epimastigotas ao epitélio intestinal de Rhodnius prolixus; assim como os anticorpos anti-calpaínas foram capazes de inibir significativamente a interação com o inseto vetor. Por fim, foi possível observar uma redução significativa no processo de diferenciação por metaciclogênese em meio TAU e alterações ultraestruturais em reservossomos, Golgi e membrana plasmática quando formas epimastigotas do T. cruzi foram tratadas com MDL28170.. Embora mais estudos sejam necessários para melhor caracterizar moléculas similares às calpaínas no T. cruzi, o nosso trabalho acrescenta novos conhecimentos sobre as possíveis funções dessas moléculas e sobre a possibilidade de utilização de inibidores de calpaínas como uma alternativa promissora para o desenvolvimento de compostos mais potentes e seletivos para o tratamento da doença de Chagas. / The calpains are a family of cysteine ​​peptidases neutral calcium dependent present in a wide variety of organisms. Due to the physiological relevance of such proteases, calpain inhibitors have already been developed for the treatment of human diseases and microbial. Recent studies have reported the presence of several proteins related to calpain in trypanosomatids, but little is known about the specific functions of these proteins in these micro-organisms. In this context, since the drugs currently available for the treatment of Chagas' disease have serious side effects and can be ineffective, proteolytic inhibitors could be an alternative in treatment of this disease. Therefore, the present study investigates the presence of molecules similar to calpain in Trypanosoma cruzi and the inhibitory effect of calpain inhibitor III (MDL28170) on proliferation, viability, differentiation, ultrastructure and interaction of the different forms of the parasite with host cells in vitro tests . Our results reveal the cross-reactivity of antibodies produced against calpains already well-characterized Drosophila melanogaster, and Homarus americanus. Trypanosoma brucei against surface molecules of T. cruzi, as demonstrated by immunofluorescence and flow cytometry. In assays Western Blotting was observed that the anti-DM-calpain was able to react against a protein of 80 kDa. Surveys conducted in GenBank showed the presence of 4 nomólogas the calpain sequences of D. melanogaster genome of T. cruzi. These four sequences were identified as cysteine ​​paptidases predicted molecular mass of around 80 kDa. In inhibition assays with MDL28170 was possible to observe a reduction in the proliferation of epimastigotes over 5 days of culture, a significant reduction in the viability of blood trypomastigotes of parasites treated with 25 mM of the compound. The inhibitor added at concentrations of 6.25 to 25 mM, was also able to decrease in a dose-and time-dependent number of infected macrophages and the number of parasites internalized interaction assays with murine peritoneal macrophages. The MDL28170 in concentration from 12.5 mM still had a significant inhibitory effect on the adhesion of epimastigotes to the intestinal epithelium of Rhodnius prolixus, as well as anti-calpain were able to significantly inhibit the interaction with the insect vector. Finally, we observed a significant reduction in the differentiation process by metacyclogenesis amid TAU and ultrastructural changes in reservossomos, Golgi and the plasma membrane when epimastigotes of T. cruzi were treated with MDL28170 .. Although more studies are needed to better characterize molecules similar to calpains in T. cruzi, our work adds new insights into the possible roles of these molecules and the possibility of using inhibitors of calpain as a promising alternative for the development of more potent and selective compounds for the treatment of Chagas' disease.