A Proteína Dissulfeto Isomerase (PDI, E.C. 5.3.4.1), pertencente à superfamília das tiorredoxinas, é uma tiol oxidorredutase que catalisa a oxidação e redução de tióis e a isomerização de dissulfetos intramoleculares. Essa chaperona tem atividade dependente de cisteínas presentes nos sítios ativos, e está presente no retículo endoplasmático (RE) e/ou na membrana plasmática de células eucarióticas. Estudos anteriores da atividade catalítica de PDI foram realizados utilizando-se como pseudo-substratos, entre eles, a di-eosinaglutationa oxidada (Di-E-GSSG), que se mostrou ótima ferramenta para o monitoramento da atividade de dissulfeto redutase da PDI. Nesse trabalho, a síntese e purificação cromatográfica de Di-E-GSSG foram realizadas e a pureza da sonda foi verificada através de cromatografia líquida de alta performance (CLAE). A cinética enzimática da atividade redutase de PDI isolada recombinante sobre Di-E-GSSG foi estudada, caracterizando-se os principais parâmetros físico-químicos da enzima através da formação do monômero fluorescente (λexc=521nm; λemi=542 nm) eosina-glutationa reduzida (E-GSH). O valor da constante de Michaelis-Menten (Km) encontrado foi de 520,5±129,8 nM, a velocidade máxima de catálise (Vmáx) foi determinada como 1,637±0,1526 nM.min-¹ e a constante catalítica (Kcat) encontrada foi 1,364 . 10-³.s-³. São relatados na literatura poucos compostos químicos capazes de inibir a atividade catalítica da PDI. Assim, para verificar se compostos radicalares estáveis desempenham essa atividade, foram testados nitróxidos piperidínicos como possíveis inibidores de PDI. Esses compostos, que possuem propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e radioprotetoras, apresentam efeito “scavenger” sobre diferentes espécies radicalares, dentre as quais, radicais tiila. O nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol) mostrou-se um inibidor pouco potente da atividade redutase da enzima. Entretanto, três outros nitróxidos, sintetizados especificamente para este trabalho, demonstraram maior poder de inibição, com uma correlação direta com o aumento de hidrofobicidade das estruturas químicas dos mesmos. Essa capacidade de inibição foi confirmada sobre a atividade de PDI presente em plaquetas humanas, corroborando a hipótese de que os nitróxidos são candidatos a novos fármacos moduladores de funções celulares onde esteja envolvida a atividade de PDI. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) belonging to the thioredoxin superfamily, is a thiol oxidoreductase that catalyzes the oxidation and reduction of thiols and intramolecular disulfide isomerization. This chaperone, such activity is dependent of cysteine located on the active sites, is present in the endoplasmic reticulum (ER) and / or plasma membrane of eukaryotic cells. Previous studies of the catalytic activity of PDI were performed using different pseudo-substrates, among them, the di-eosin-glutathione disulfide (Di-E-GSSG), described as a usefull tool for monitoring the disulfide reductase activity of PDI . In this work, the synthesis and chromatographic purification of Di-E-GSSG were performed and the purity of the probe was verified by high performance liquid chromatography (HPLC). The enzyme kinetics of the reductase activity of recombinant PDI isolated over Di-E-GSSG was studied, characterizing the main physicochemical parameters of the enzyme through the formation of the fluorescent monomer (λexc=521nm; λemi=542nm) eosin-reduced glutathione (E-GSH). The value of the Michaelis-Menten constant (Km) was found to be 520.5 ± 129.8 nM, the maximum velocity of catalysis (Vmáx) was determined as 1,637 ± 0.1526 nM.min-¹ and the catalytic constant (Kcat) found was 1.364 . 10-³.s-¹. Few chemical compounds able to inhibit catalytic activity of PDI were reported. Thus, to verify if stable free radical compounds display this activity were tested piperidine nitroxides as potential inhibitors of PDI. These compounds, which have antioxidant, anti-inflammatory and radioprotective properties are “scavengers” of different radical species, among them, thyil radicals. The nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetrametilpiperidine-1-oxyl (Tempol) was a weak inhibitor of PDI reductase activity. However, three other nitroxides specifically synthesized for this study showed higher inhibition power, with a direct correlation between increasing the hydrophobicity of the chemical structures and inhibitory action. This ability was confirmed by assays with PDI found in human platelets, confirming the hypothesis that the nitroxides are candidates for new drugs to modulate cellular functions involving the PDI activity.