Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:28:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueiredo_IsisMartins_D.pdf: 1626484 bytes, checksum: 2c55f1a5b794f6f6e1c4a4931c394c4d (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante as últimas décadas, muitos métodos de RMN de H foram desenvolvidos e aplicados para triagem e caracterização de interações intermoleculares e para a metabonômica. Estes são temas recentes da RMN e ambos serão abordados em dois capítulos distintos neste trabalho. No Capítulo 1 foi realizada a implantação e otimização de técnicas de RMN como (STD, WaterLOGSY, NOE pumping e DOSY-NOESY). Para tanto, utilizou-se um sistema composto por albumina de soro bovino BSA e uma mistura de cinco compostos (ác. salicílico, cafeína, ác. cítrico, ác. adipico e D-glucose) dentre os quais, apenas o ácido salicílico e a cafeína interagiram com a BSA. Além disso, uma análise comparativa entre as técnicas permitiu afirmar que os experimentos de STD e WaterLOGSY são os mais sensíveis e rápidos fornecendo complementarmente o domínio hidrofóbico e hidrofílico de ligação com o ligante. Com intuito de confirmar nossa habilidade na aplicação destas técnicas, as mesmas foram aplicadas a um sistema composto por uma Chaperone Hsp70, substratos (ATP e ADP) e um polipeptíteo Angiotensina 2 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). A análise desse sistema por WaterLOGSY e a comparação com os resultados obtidos por STD permitiu a obtenção do epitopo 1 o qual é formado pela porção adenosina do A TP ou ADP quando estes estão complexados a Hsp70 e do epitopo 2 formado pela porção hidrofóbica da Angiotensina 2 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) que interage com a Hsp70. Já no Capitulo 2, a RMN de H foi aplicada na investigação da metabonômica do liquido cerebroespinal de pacientes com Esclerose Múltipla (EM). A análise dos dados de RMN através de métodos quimiométricos (HCA, PCA e PLS-DA) revelou alguns metabólitos importantes, dentre os quais o b-hidroxibutirato (1,17 ppm) e um sinal de proteína (0,065 ppm) foram detectados apenas em amostras EM podendo ser considerados marcadores de reações bioquímicas de degradação de mielina. Portanto, este estudo alcançou com êxito os objetivos traçados de implementar novas técnicas de RMN aplicadas a sistemas biológicos além de trazer novas informações sobre a Hsp70 e EM / Abstract: Over the past years H NMR methods have been developed and applied to the screening and characterization of protein epitopes in ligand receptor complexes and metabonomics. These are recent NMR methods issues of the present PhD thesis. To investigate proteinligand complexes we first optimized techniques that were unavailable at IQ/UNICAMP such as STD, WaterLOGSY, NOE pumping and DOSY-NOESY which were specially designed for epitope mapping. In order to optimized these techniques we employed a mixture of five compounds (salicilic ac., caffeine, citric ac., adipic ac. and D-glucose) and bovine serum albumine (BSA). Among the studied ligands salicilic acid and caffeine were the best. From these experiments we additionally concluded that STD and WaterLOGSY were most sensitive and appropriate for epitope mapping. A second system was investigated consisting of Chaperone Hsp70, cofactor (ATP and ADP) and polypeptide Angiotensine 2 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Epitope I was characterized as containing a lipophylic domain in which the adenosine portion of ATP or ADP was bound to Hsp70. Epitope 2 was the polypeptide-binding site in which the apoIar portion of Angiotensine 2 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) was tightly bound to Hsp70. In chapter 2, H NMR was the major tool employed to investigate the metabonomics of CSF of Multiple Sclerosis patients. Analyses of the H NMR data applying quimiometric methods (HCA, PCA and PLS-DA) revealed that some metabolites, from which b-hydroxybutirate (1,17 ppm) and a protein signal (0,065 ppm) were detected in EM patients only. These signals were never described as EM biomarkers before. To match these observations a full set of lipolytic and proteolytic biochemical reactions were proposed which are responsible for myelin degradation. Therefore, in this study we describe the successful implementation of these new NMR techniques that were applied to biological systems revealing new aspects of the Hsp70 and MS / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prando_Alessandra_D.pdf: 9977861 bytes, checksum: 15d25bce7d95433f95b938e68fdeaac8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Até o momento, pouco se sabe sobre os mecanismos de virulência da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC), agente causador do cancro cítrico. Acredita-se que chaperonas de secreção (CS) estão envolvidas no processo de patogenicidade de XAC primeiramente formando complexos com fatores de virulência e auxiliando no encaminhamento desses para os sistemas de secreção utilizando o ATP como fonte de energia. Neste trabalho foram adquiridos dados de fluorescência de emissão, dicroísmo circular, desenovelamento térmico e de ressonância magnética nuclear de H NMR e de 2D {N,H} HSQC de duas proteínas da XAC, a XAC1990 (FlgN) e XACb0033. Para ambas proteínas foram propostas estruturas 3D usando a análise de footprinting com restrições SASA e rmsd. Para as estruturas propostas foi verificado que os dados de fluorescência corroboram com a estrutura 3D não ocorrendo o mesmo para os dados de CD e NMR que revelaram baixo conteúdo helicoidal além de ausência de estrutura 3 D. A interação da proteína FlgN com a sua proteína parceira FlgK também foi sugerida através das análises de CD e fluorescência. Na segunda parte do trabalho foram estudadas as interações entre a proteína Hsp90 da laranja com diferentes ligantes aplicando a técnica de Saturation Transfer Difference (STD-NMR) e espectroscopia de fluorescência. Estas análises revelaram dados que corroboraram com o modelo proposto e, além disso, indicaram que os hidrogênios H-8 e H-2 da adenina e H-1'da ribose estão localizados no sítio ligante da proteína com os fosfatos orientados para fora. Através da fluorescência foram calculados os valores de Kd e foi verificado que a geldanamicina é um potente inibidor de Hsp90 da laranja / Abstract: So far, the Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC) mechanisms of bacterial virulence is unknown. It is believed that secretion chaperones (CS) are involved in the XAC's virulence process by first forming complexes with virulence factors, and assisting in their presentation to corresponding secretion systems using ATP as a source of energy. Fluorescence emission, circular dichroism, thermal unfolding and nuclear magnetic resonance NMR H and 2D {N,H} HSQC data from two proteins of XAC, XAC1990 (FlgN) and XACb0033 were collected. For both proteins, 3D structures were proposed using the footprinting analysis with RMSD and SASA restrictions. For the proposed structures were verified which the fluorescence data were consistent with the 3D structure. The CD and NMR data revealed low-helical content and absence of 3D structure. The interaction of the protein FlgN with its partner, FlgK, was suggested by CD and fluorescence analysis. In the second part, the interactions between the orange's Hsp90 protein with different ligants using Saturation Transfer Difference (STD-NMR) and fluorescence spectroscopy techniques were studied. These analyzes revealed which the data were consistent with the proposed model and moreover showed that the adenine's hydrogens H-8 and H-2 and ribose's hydrogen H-1'are located in the protein binding site with the phosphate driven out. By fluorescence values were calculed Kd and it was verified that geldanamycin is a potent inhibitor of orange's Hsp90 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências