A classe de proteínas das MEGs (codificadas por genes de micro-éxon) presente em Schistosoma mansoni, ganhou evidência após a publicação do genoma deste parasita, principalmente por ser majoritariamente secretada, estando em contato direito com moléculas do hospedeiro, e possuir alta taxa de variação, o que poderia ter relação com um possível um mecanismo de evasão do sistema imune. Assim, foram escolhidas proteínas da classe das MEGs, todas com predição de hélice anfipática em sua estrutura, para investigação neste trabalho. Hélices anfipáticas são amplamente descritas na literatura como tendo alta propensão à interação com membranas celulares e interessantes funções fisiológicas. O objetivo deste projeto foi estudar a dinâmica de interação com membranas e estabelecer possíveis indícios de função biológica das proteínas MEG-24 e MEG-27 a partir de técnicas biofísicas. Optou-se por trabalhar com essas proteínas produzidas a partir da síntese química. Utilizando as técnicas de CD, Fluorescência e DLS, observou-se que a presença de miméticos de membrana induzem o enovelamento e o aumento da estabilidade térmica de MEG-27, e interferem no seu estado oligomérico. Para MEG-24, também foi observado aumento da estabilidade térmica e influência no estado oligomérico na presença de sistemas miméticos de membrana. Utilizando OCD, inferiu-se que MEG-27 possivelmente interage com a superfície da membrana, a passo que MEG-24 se insere na bicamada. Adicionalmente, ambas foram capazes de interferir na dinâmica de vesículas, conforme observado pelo ensaio de vazamento de calceína e DSC. Utilizando células de eritrócito e um modelo de membrana a partir dessas células (ghosts) foram realizados ensaios biológicos, DSC e EPR. A capacidade de MEG-24 e MEG-27 realizarem hemólise e hemoaglutinação, respectivamente, reitera o potencial de interação destas proteínas com membranas biológicas. Os resultados de DSC apontaram que ambas interferem nas transições das proteínas de membrana embebidas na bicamada de ghosts de eritrócitos. Por EPR, notou-se que MEG-27 tem maior efeito na dinâmica de lipídios em detrimento a MEG-24, possivelmente devido a um mecanismo de acomodação envolvendo domínios raft e a diferença de orientação de interação entre ambas as proteínas. A expressão de MEG-27 exclusivamente na região da glândula do esôfago em vermes adultos verificada por WISH, sugere que a mesma deva entrar em contato com células recém ingeridas pelo parasita. Não foi observada atividade antimicrobiana para ambas e não foram encontrados parceiros de interação proteínas pela técnica de Duplo-híbrido para MEG-27. Concluiu-se que os peptídeos estudados interagem com membranas biológicas, podendo ter papéis importantes na interface de interação parasito-hospedeiro. / The class of MEGs proteins (coded by micro-exon genes) present in Schistosoma mansoni, drawn attention after the parasite genome publication. This proteins are mostly secreted, being in direct contact with host molecules and with a high rate of variation, which could be a mechanism of Imune system evasion. Thus, proteins of the MEGs class, all with amphipathic prediction in their structure, were chosen for investigation in this work. Amphipathic helices are widely described in the literature with high propensity to interact with membranes and, consequently, probability of related biological function. The objective of this project was to study the interaction dynamics with membranes and to establish possible indications of biological function of MEG-24 and MEG-27 proteins from biophysical techniques. We chose to work with these proteins produced by chemical synthesis. Using CD, Fluorescence and DLS techniques, it was observed that the presence of membrane mimetics induced the folding and increased thermal stability of MEG-27, and interfered with its oligomeric state. For MEG-24, an increase in thermal stability and influence on the oligomeric state was also observed when in the presence of membrane mimetic systems. The results of OCD suggest that MEG-27 possibly interacts with the membrane surface, whereas MEG-24 is inserted into the bilayer. Both were able to interfere with vesicle dynamics, as observed by the Leakage and DSC tests. Using a more realistic membrane model from erythrocyte cells, biological assays, DSC and EPR were performed. The ability of MEG-24 and MEG-27 to perform hemolysis and hemagglutination, respectively, provides evidence of the potential for interaction of these proteins with biological membranes. The DSC results indicated that both interfere with the transitions of the membrane proteins embedded in the bilayer of erythrocyte ghosts. By EPR, it was noted that MEG-27 has a greater effect on lipid dynamics than MEG-24, possibly due to an accommodation mechanism involving raft domains and the difference in orientation of interaction between both proteins. The expression of MEG-27 exclusively in the region of the esophagus gland in adult worms verified by WISH suggests that it should come into contact with cells just ingested by the parasite. No antimicrobial activity was observed for both and no protein interaction partners were found by the MEG-27 double-hybrid technique. It was concluded that the studied peptides interact with biological membranes and may have important roles in the parasite-host interaction interface.

A classe de proteínas das MEGs (codificadas por genes de micro-éxon) presente em Schistosoma mansoni, ganhou evidência após a publicação do genoma deste parasita, principalmente por ser majoritariamente secretada, estando em contato direito com moléculas do hospedeiro, e possuir alta taxa de variação, o que poderia ter relação com um possível um mecanismo de evasão do sistema imune. Assim, foram escolhidas proteínas da classe das MEGs, todas com predição de hélice anfipática em sua estrutura, para investigação neste trabalho. Hélices anfipáticas são amplamente descritas na literatura como tendo alta propensão à interação com membranas celulares e interessantes funções fisiológicas. O objetivo deste projeto foi estudar a dinâmica de interação com membranas e estabelecer possíveis indícios de função biológica das proteínas MEG-24 e MEG-27 a partir de técnicas biofísicas. Optou-se por trabalhar com essas proteínas produzidas a partir da síntese química. Utilizando as técnicas de CD, Fluorescência e DLS, observou-se que a presença de miméticos de membrana induzem o enovelamento e o aumento da estabilidade térmica de MEG-27, e interferem no seu estado oligomérico. Para MEG-24, também foi observado aumento da estabilidade térmica e influência no estado oligomérico na presença de sistemas miméticos de membrana. Utilizando OCD, inferiu-se que MEG-27 possivelmente interage com a superfície da membrana, a passo que MEG-24 se insere na bicamada. Adicionalmente, ambas foram capazes de interferir na dinâmica de vesículas, conforme observado pelo ensaio de vazamento de calceína e DSC. Utilizando células de eritrócito e um modelo de membrana a partir dessas células (ghosts) foram realizados ensaios biológicos, DSC e EPR. A capacidade de MEG-24 e MEG-27 realizarem hemólise e hemoaglutinação, respectivamente, reitera o potencial de interação destas proteínas com membranas biológicas. Os resultados de DSC apontaram que ambas interferem nas transições das proteínas de membrana embebidas na bicamada de ghosts de eritrócitos. Por EPR, notou-se que MEG-27 tem maior efeito na dinâmica de lipídios em detrimento a MEG-24, possivelmente devido a um mecanismo de acomodação envolvendo domínios raft e a diferença de orientação de interação entre ambas as proteínas. A expressão de MEG-27 exclusivamente na região da glândula do esôfago em vermes adultos verificada por WISH, sugere que a mesma deva entrar em contato com células recém ingeridas pelo parasita. Não foi observada atividade antimicrobiana para ambas e não foram encontrados parceiros de interação proteínas pela técnica de Duplo-híbrido para MEG-27. Concluiu-se que os peptídeos estudados interagem com membranas biológicas, podendo ter papéis importantes na interface de interação parasito-hospedeiro. / The class of MEGs proteins (coded by micro-exon genes) present in Schistosoma mansoni, drawn attention after the parasite genome publication. This proteins are mostly secreted, being in direct contact with host molecules and with a high rate of variation, which could be a mechanism of Imune system evasion. Thus, proteins of the MEGs class, all with amphipathic prediction in their structure, were chosen for investigation in this work. Amphipathic helices are widely described in the literature with high propensity to interact with membranes and, consequently, probability of related biological function. The objective of this project was to study the interaction dynamics with membranes and to establish possible indications of biological function of MEG-24 and MEG-27 proteins from biophysical techniques. We chose to work with these proteins produced by chemical synthesis. Using CD, Fluorescence and DLS techniques, it was observed that the presence of membrane mimetics induced the folding and increased thermal stability of MEG-27, and interfered with its oligomeric state. For MEG-24, an increase in thermal stability and influence on the oligomeric state was also observed when in the presence of membrane mimetic systems. The results of OCD suggest that MEG-27 possibly interacts with the membrane surface, whereas MEG-24 is inserted into the bilayer. Both were able to interfere with vesicle dynamics, as observed by the Leakage and DSC tests. Using a more realistic membrane model from erythrocyte cells, biological assays, DSC and EPR were performed. The ability of MEG-24 and MEG-27 to perform hemolysis and hemagglutination, respectively, provides evidence of the potential for interaction of these proteins with biological membranes. The DSC results indicated that both interfere with the transitions of the membrane proteins embedded in the bilayer of erythrocyte ghosts. By EPR, it was noted that MEG-27 has a greater effect on lipid dynamics than MEG-24, possibly due to an accommodation mechanism involving raft domains and the difference in orientation of interaction between both proteins. The expression of MEG-27 exclusively in the region of the esophagus gland in adult worms verified by WISH suggests that it should come into contact with cells just ingested by the parasite. No antimicrobial activity was observed for both and no protein interaction partners were found by the MEG-27 double-hybrid technique. It was concluded that the studied peptides interact with biological membranes and may have important roles in the parasite-host interaction interface.

O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato). / The use of chlorinated compounds bearing aromatic structures in their chemical composition has quickly grown in the last few years due to their general presence in processes of modern industry. The degradation of such compounds is slow, due to their high chemical stability, thus making them frequent polutants of the environment. Different strategies to tackle this problem are available. The so-called bioremediation methods are among those strategies and have been gaining many applications because of their higher efficiency and due to the use of enzymes, which do not affect the environment, to perform the degradation task. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida is one of those enzymes and is the object of study of this project. Our group has been working on understanding the mechanism of action of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida since we believe that a more efficient use of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida necessarily involves knowledge about ways of controlling the enzymatic activity. Thus, our results consisted in the optimization of the expression and purification protocols that allow the production of pure protein in high yields after changing its expression vector. Assays of enzyme activity with different substrates and development of a protocol for kinetic characterization was also done to assess the existence of mechanisms of inhibition/modulation of the reaction by the substrate and/or product. Analysis of the secondary structure by circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism was also performed to assess the integrity of the new construction. Tests were also carried out to separate the amphipatic ligands present in the Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida structure for analysis in a mass spectrometer in order to identify which kind of amphipathic molecule may be present in enzyme hydrophobic site. Finally, lipid-protein interactions were investigated by means of differential scanning calorimetry, electron paramagnetic resonance and circular dichroism. The results indicated a potential interaction with model membranes, especially in the presence of PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate).

O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato). / The use of chlorinated compounds bearing aromatic structures in their chemical composition has quickly grown in the last few years due to their general presence in processes of modern industry. The degradation of such compounds is slow, due to their high chemical stability, thus making them frequent polutants of the environment. Different strategies to tackle this problem are available. The so-called bioremediation methods are among those strategies and have been gaining many applications because of their higher efficiency and due to the use of enzymes, which do not affect the environment, to perform the degradation task. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida is one of those enzymes and is the object of study of this project. Our group has been working on understanding the mechanism of action of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida since we believe that a more efficient use of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida necessarily involves knowledge about ways of controlling the enzymatic activity. Thus, our results consisted in the optimization of the expression and purification protocols that allow the production of pure protein in high yields after changing its expression vector. Assays of enzyme activity with different substrates and development of a protocol for kinetic characterization was also done to assess the existence of mechanisms of inhibition/modulation of the reaction by the substrate and/or product. Analysis of the secondary structure by circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism was also performed to assess the integrity of the new construction. Tests were also carried out to separate the amphipatic ligands present in the Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida structure for analysis in a mass spectrometer in order to identify which kind of amphipathic molecule may be present in enzyme hydrophobic site. Finally, lipid-protein interactions were investigated by means of differential scanning calorimetry, electron paramagnetic resonance and circular dichroism. The results indicated a potential interaction with model membranes, especially in the presence of PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate).