Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-28T10:46:28Z No. of bitstreams: 1 julianafrancamonteirodemendonca.pdf: 2542669 bytes, checksum: 4bb85fe6239ae04615793a019786fe59 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-05-02T01:07:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 julianafrancamonteirodemendonca.pdf: 2542669 bytes, checksum: 4bb85fe6239ae04615793a019786fe59 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-02T01:07:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 julianafrancamonteirodemendonca.pdf: 2542669 bytes, checksum: 4bb85fe6239ae04615793a019786fe59 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Em muitos casos, o leite e seus derivados são responsáveis por causar doenças transmitidas por alimentos pela veiculação de micro-organismos, como Salmonella spp. e Staphylococcus aureus. A contaminação desses produtos pode ocorrer, principalmente, devido ao processamento térmico ineficiente ou à falta de observação das práticas de higiene e limpeza durante as diversas etapas do processo produtivo, como na manipulação do alimento ou, até mesmo, após o tratamento térmico. Assim, a identificação rápida de patógenos presentes em alimentos é de extrema importância, tanto para a garantia da qualidade dos produtos, quanto em casos de surtos. Nestes casos o uso de métodos altamente sensíveis e específicos para detectar patógenos alimentares se torna indispensável. Uma das técnicas que tem sido utilizada para este fim é a PCR em Tempo Real (qPCR), devido a sua rapidez e eficiência na identificação de patógenos em alimentos. Contudo, uma das grandes desvantagens dessa técnica é a sua incapacidade em diferenciar o DNA de células viáveis e inviáveis dos patógenos. Para suplantar tal ponto, o brometo de etídeo monoazida (EMA) pode ser usado para detectar somente células viáveis. O EMA é um intercalante de DNA que pode entrar seletivamente em células com membrana danificada (consideradas inviáveis) e se ligar covalentemente ao seu DNA, quando exposto à luz halógena, inibindo sua amplificação durante a qPCR. Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi estabelecer um protocolo para detecção em multiplex de células viáveis de Salmonella spp. e S. aureus em culturas puras e em Queijo de Coalho pelo uso do EMA combinado à qPCR. O protocolo estabelecido foi eficaz para a identificação de células viáveis de Salmonella spp., tanto em culturas puras quanto em Queijo de Coalho. Entretanto, foi observado que a diferenciação de células viáveis e inviáveis de S. aureus pelo uso do EMA não foi eficiente. Portanto, não foi possível realizar a detecção de células viáveis dos patógenos em multiplex em culturas puras e em Queijo de Coalho. Além disso, observou-se que o protocolo estabelecido, combinando a técnica de qPCR aliada ao uso do EMA, foi capaz de detectar concentrações tão baixas de células viáveis de Salmonella typhimurium quanto 101 UFC/10g de Queijo de Coalho. Contudo, somente foi possível diferenciar estatisticamente as médias dos valores de Cycle threshold (Ct) em concentrações de células superiores a 103 UFC/10 g de queijo. O protocolo desenvolvido é, portanto, uma ferramenta útil para a vigilância de alimentos, uma vez que fornece identificação rápida e específica de células viáveis de Salmoenlla spp. em Queijo de Coalho. / In many cases, milk and milk products are responsible to cause foodborne illness through transmission of microorganisms, like Salmonella spp. and Staphylococcus aureus. The contamination of these products can mainly occur due inefficient thermal processing or the lack of practices of hygiene and cleaning during the various stages of the production process, like occur during food handling or, even, after the thermal treatment. The rapid identification of pathogens in foods is extremely important, both for the quality assurance of products, such as in cases of outbreaks. Thus, the use of highly sensible and specific methods to detect food pathogens becomes indispensable. One of the techniques has been used to this is the Real Time PCR (qPCR), due its quickness and efficiency to identify pathogens in foods. Nevertheless, one of the major disadvantages of this technique is its inability to differentiate the DNA of viable and nonviable cells of microorganisms. To overcome this drawback, the ethidium bromide monoazide (EMA) can be used to detect viable cells only. EMA is a DNA intercalating dye that can enter selectively in cells with damaged membrane (considered dead) and bind covalently to DNA when exposed to halogen light, inhibiting its amplification during qPCR. So, the aim of this work was establish a protocol to detect in multiplex viable cells of Salmonella spp. and Staphylococcus aureus in pure cultures and Coalho cheese by use of EMA combined to Real-time PCR technique. The protocol established is efficient to identify viable cells of Salmonella spp., both in pure culture as for Coalho cheese. However, was observed that the differentiation between viable and nonviable cells of S. aureus by use of EMA is not efficient. Therefore, is not possible to detect viable cells of these pathogens in multiplex in pure cultures and in Coalho cheese. Moreover, it was observed that the established protocol, combining the qPCR technique and EMA, was able to detect viable cells concentrations of Salmonella typhimurium as low as 101 CFU/10g of Coalho cheese. However, it could only statistically differentiate the means of Cycle threshold (Ct) values in cells concentrations above to 103 UFC/10 g of cheese. The developed protocol is, therefore, an useful tool for food surveillance, since it provides rapid and specific identification of viable cells of Salmonella spp. in Coalho cheese.