One of the major limitations in drug development and gene therapy for brain diseases is the natural defensive structure called the blood brain barrier (BBB), which prevents therapeutic polypeptide drugs and viral vectors from entering the brain. Intranasal delivery of therapeutic gene products into the brain offers a non-invasive alternative towards a feasible gene and protein therapy for neurological diseases. From recent studies involving axonal transport, it is tempting to speculate that therapeutic macromolecules including neurotrophic factors and viral vectors can be delivered into the brain by peripheral neurons, such as olfactory receptor neurons (ORNs), which span the BBB. It is thought that the nasal pathway into the brain involves two general mechanisms; intracellular (intraneuronal) or extracellular routes of transport. However the pathways involved have not yet been fully characterized. In this study I firstly investigated the temporal and spatial localisation pattern of both biotinylated and I125 labelled ciliary neurotrophic factor (CNTF) following nasal delivery into Sprague-Dawley rats. Results showed that intranasal delivered CNTF was transported to several brain regions by both intracellular axonal pathway through ORNs and the extracellular trigeminal pathway. Excess unlabelled CNTF competed for receptor binding in the olfactory mucosa confirming receptor mediated intracellular transport to the olfactory bulb via ORNs. Denervation of the olfactory mucosa prior to CNTF delivery failed to prevent CNTF transport to trigeminal and hypothalamic brain regions. Intranasal delivered CNTF was biologically active, resulting in activation of the STAT3 signalling pathway in the thalamus and hypothalamus. To examine the functional activity of intranasal delivered CNTF, I conducted a weight loss trial using an obese Zucker rat (OZR) model to test whether CNTF treatment caused body weight loss. Intranasal administration of CNTF resulted in reduced body weight in the CNTF treated OZR group compared to the BSA control group during the 12 day trial and for 3 days after. Intranasal delivery of CNTF may be a valuable method for the treatment of obesity. In the second study, I investigated the temporal and spatial expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) transferred by a single nasal delivery of either a recombinant adenovirus vector (Ad5CMV-EGFP) or an adeno-associated virus vector (AAV2-EGFP) into Sprague-Dawley rats. Adenovirus mediated EGFP expression was localized in ORNs throughout the olfactory epithelium after 24 hours. EGFP in the ORNs appeared to be anterogradely transported along their axons to the olfactory bulb and transferred in glomeruli to second-order neurons. EGFP was transferred to several brain regions including the cortex, hippocampus, and brainstem after 7 days. EGFP expression co-localized with Olfactory Marker Protein and was confirmed with EGFP immunofluorescence labelling and western blotting. AAV expressed EGFP localized in similar olfactory and brain regions 6 weeks after delivery. mRNA levels suggested that the AAV-EGFP construct was only incorporated into olfactory mucosa cells and the viral vector was not present in olfactory bulb and brain regions. In conclusion, this simple and non-invasive polypeptide and gene delivery method provides ubiquitous macromolecule distribution throughout the rodent brain and may be useful for the treatment of neurological disorders.

No description available.

[ES] Los tumores malignos del cerebro y del sistema nervioso central representan el 21% de los tumores en niños y son la segunda causa principal de muerte por cáncer pediátrico después de la leucemia. Los gliomas de alto grado siguen siendo incurables y poseen altas tasas de mortalidad: una supervivencia a cinco años del 4,7 % para pacientes con glioblastoma multiforme (GBM) y menos de un año en pacientes con glioma pontino intrínseco difuso (DIPG). Los bajos niveles de penetración del fármaco a través de la barrera hematoencefálica y la baja tasa de supervivencia asociada resaltan en la necesidad de nuevas propuestas de tratamiento para esta necesidad clínica no cubierta. La administración intranasal ofrece un enfoque no invasivo prometedor que elude el metabolismo hepato-gastrointestinal y la barrera hematoencefálica, constituyendo una ruta directa de la nariz al cerebro. Los poliglutamatos (PGA) representan excelentes candidatos para la administración de agentes terapéuticos en el cerebro debido a su biodegradabilidad y multivalencia, lo que permite la unión covalente de fármacos y grupos directores que puedan contribuir a cruzar las diferentes barreras biológicas existentes desde la nariz hasta el cerebro. La conjugación covalente del agente terapéutico a la cadena polimérica ofrece una estabilidad prolongada en la circulación sanguínea y un mayor control sobre la liberación del fármaco en el microambiente tumoral. Esta tesis se centra en el diseño racional y desarrollo de nuevos conjugados PGA-fármaco y una plataforma intranasal segura y eficiente para la administración dirigida y la liberación del fármaco en el cerebro como tratamiento del glioma pediátrico. Se desarrolló una familia de conjugados de poliglutamatos que incorporan palbociclib, un inhibidor de CDK, utilizando diferentes espaciadores sensibles a estímulos, así como diferente carga de fármacos. Estudiamos el efecto de la carga y conjugación de un fármaco sobre la conformación en solución de PGAs lineales y en forma de estrella. Con dispersión de rayos X de ángulo pequeño y dicroísmo circular, demostramos la evolución del conjugado polipeptídico al aumentar la carga de fármaco. Además, establecimos el vínculo entre la conformación de los conjugados y su actividad biológica en células GBM y DIPG derivadas de pacientes. Nuestros hallazgos ilustran la necesidad de una comprensión profunda de las propiedades fisicoquímicas de los nanosistemas estudiados que pueden ayudar a predecir su resultado biológico. Para el cribado rápido y la validación de la formulación intranasal, establecimos con éxito una plataforma de detección ex vivo basada en células de difusión verticales de Franz con mucosa nasal de oveja. Varios sistemas basados en PGA lineal y en forma de estrella modificadas con diferentes ligandos (incluyendo el ácido docosahexaenoico, ácido hialurónico (HA), odorranalectina), así como sistemas entrecruzados del PGA en forma de estrella y la mezcla física con un HA entrecruzado (HA-CP®). A continuación, se realizó estudios de biodistribución mediante administración intranasal de los candidatos seleccionados, seguidos de la cuantificación ex vivo con la técnica IVIS y el ensayo de fluorescencia estándar después de la homogeneización de órganos y los estudios histológicos del cerebro. Los datos obtenidos mostraron claramente la presencia de las diferentes plataformas en el cerebro e, su internalización en células del bulbo olfativo y una buena difusión en el cerebro a través de diferentes áreas, llegando incluso a detectarse en el hipocampo. Los candidatos seleccionados se han escalado y en la actualidad su evaluación biológica en un modelo in vivo está en curso. En conclusión, se ha diseñado, desarrollado y validado diferentes plataformas basadas en PGA capaces de llegar al cerebro a través de la administración intranasal, constituyendo una base prometedora para el tratamiento de múltiples trastornos relacionados con el cerebro. / [CA] Els tumors malignes del cervell i del sistema nerviós central representen el 21% dels tumors en nens i són la segona causa principal de mort per càncer pediàtric després de la leucèmia. Els gliomes d'alt grau que continuen sent incurables amb taxes de mortalitat altes: una supervivència a cinc anys del 4,7 % per a pacients amb glioblastoma multiforme (GBM) i menys d'un any en pacients amb glioma pontí intrínsec difús (DIPG). Els nivells baixos de penetració del fàrmac a través de la barrera hematoencefàlica i la baixa taxa de supervivència associada ressalten en la necessitat de noves propostes de tractament per a una necessitat clínica no satisfeta. L'administració intranasal ofereix un enfocament no invasiu prometedor que eludeix el metabolisme hepatogastrointestinal i la barrera hematoencefàlica, cosa que permet l'administració directa del nas al cervell. Els poliglutamats (PGA) representen excel·lents candidats per a l'administració al cervell a causa de la seva biodegradabilitat i multivalència, la qual cosa dóna suport a la introducció covalent de fàrmacs i grups objectiu i pot facilitar la transició del nas al cervell. La conjugació covalent de l'agent terapèutic a la cadena polimèrica ofereix una estabilitat prolongada en la circulació sanguínia i un major control sobre l'alliberament del fàrmac al microambient tumoral. Aquesta tesi se centra en el desenvolupament de nous conjugats PGA-fàrmac dissenyats racionalment i una plataforma intranasal segura i eficient per a l'administració dirigida i l'alliberament del fàrmac al cervell com a tractament del glioma pediàtric. Es va desenvolupar una família de conjugats de poliglutamat que incorporen l'inhibidor de CDK palbociclib, utilitzant diferents enllaçadors sensibles a estímuls i nivells variables de càrrega de fàrmacs. Estudiem l'efecte del fàrmac hidrofòbic conjugat sobre la conformació en solució de PGA lineals i en forma d'estrella. Amb dispersió de raigs X d'angle petit i dicroisme circular, demostrem l'evolució del sistema conjugat en augmentar la càrrega de fàrmac. A més, establim el vincle entre la conformació dels conjugats i la seva activitat biològica provada en cèl·lules GBM i DIPG derivades de pacients. Les nostres troballes van il·lustrar la necessitat d'una comprensió profunda de les propietats fisicoquímiques dels nanosistemes estudiats que poden ajudar a predir-ne el resultat biològic. Per a la detecció ràpida de la formulació intranasal basada en els portadors de PGA, vam establir amb èxit una plataforma de detecció ex vivo basada en cèl·lules de difusió verticals de Franz amb mucosa d'ovella. Diversos sistemes basats en PGA lineal i en forma d'estrella amb fraccions conjugades (inclòs l'àcid docosahexaenoic, àcid hialurònic (HA), odorranalectina), així com partícules reticulades (a través de cicloaddició azida-alquí o enllaços disulfur) i la barreja física amb un HA es van provar els polímers creuats (HA-CP®). Els estudis de biodistribució després de l'administració intranasal es van fer en candidats seleccionats, seguits de la quantificació ex vivo amb la tècnica IVIS i l'assaig de fluorescència estàndard després de l'homogeneïtzació d'òrgans i els estudis histològics del cervell. Les dades obtingudes van mostrar clarament el transport del nas al cervell, la internalització cel·lular dels conjugats al bulb olfactiu i, el que és més interessant, una bona difusió del cervell a través de diferents àrees, arribant fins i tot a l'hipocamp. Els sistemes seleccionats es van ampliar i la preparació per a l'avaluació biològica en un model in vivo està en curs. En general, vam ser capaços de dissenyar, desenvolupar i validar diferents plataformes basades en PGA capaces d'arribar al cervell mitjançant l'administració intranasal, la qual cosa podria ser la base per al tractament de múltiples trastorns relacionats amb el cervell. / [EN] Malignant brain and central nervous system tumors account for ~21% of tumors in children and represent the second leading cause of pediatric cancer deaths after leukemia. Standard chemotherapy allows a ~95% five-year survival rate for patients with low-grade gliomas. Unfortunately, high-grade gliomas remain generally incurable and suffer from high mortality rates - a 4.7% five-year survival for glioblastoma multiform (GBM) patients and less than one year in patients with diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Low levels of drug delivery through the blood-brain barrier (BBB) and the associated poor survival rate highlight the necessity for novel treatment approaches for an unmet clinical need. Intranasal administration offers a promising non-invasive approach that circumvents hepato-gastrointestinal metabolism and the BBB, thereby enabling direct nose-to-brain delivery. Polyglutamates (PGAs), represent excellent candidates for brain delivery due to their biodegradability and multivalency, which supports the covalent introduction of drugs and targeting moieties to facilitate the nose-to-brain transition. Covalent conjugation of therapeutic agents to the polymeric main chain offers prolonged stability in the blood circulation and increased control over the drug release in the tumor microenvironment if adequately designed considering endogenous triggers, including acidic pH, an increased reductive environment, or the overexpression of specific proteases. This thesis focuses on developing novel, rationally-designed PGA-drug conjugates as a safe and efficient intranasal platform for targeted delivery and drug release in the brain as a pediatric glioma treatment. We developed a family of PGA-drug conjugates incorporating the CDK inhibitor palbociclib that employed different stimuli-responsive linkers and varying drug loading levels and studied the effect of drug loading on the solution conformation of linear and star-shaped PGAs. We demonstrated system evolution upon increased drug loading with SAXS and CD. Moreover, we established a link between conjugate conformation and their biological activity, as evaluated in patient-derived GBM and DIPG cells. Our findings illustrated the necessity of a deep understanding of the physico-chemical properties of studied nanosystems that can aid in predicting their biological outcome. For the development of an intranasal formulation, we successfully established an ex vivo screening platform based on vertical Franz diffusion cells with sheep mucosa. We evaluated several systems based on linear and star-shaped PGA with conjugated moieties (including docosahexaenoic acid, hyaluronic acid, odorranalectin), crosslinked particles (via azide-alkyne cycloaddition or disulfide bonds), and physical mixtures with a hyaluronic acid cross polymer (HA-CP®). After intranasal administration with selected candidates, we performed biodistribution studies, followed by ex vivo quantification with the IVIS spectrum in vivo imaging system and fluorescent assays after organ homogenization and brain histological studies. The obtained data demonstrated nose-to-brain transportation, internalization of conjugates in the olfactory bulb and robust diffusion through different brain areas, even reaching the hippocampus. We also scaled up selected systems and preparations for biological evaluation in an in vivo model that is currently ongoing. Overall, we were able to design, develop, and validate different PGA-based platforms capable of arriving at the brain via intranasal, which might be the base for the treatment of multiple brain-related disorders. / Melnyk, T. (2024). Drug Dellivery to the Brain Using Polymer Therapeutics as an Intranasal Platform for Pediatric Glioblastoma Treatment [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203498