Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'infarctus du myocarde est la première cause de mortalité cardiovasculaire dans les pays occidentaux. La reperfusion la plus précoce possible est actuellement le seul traitement validé pour réduire la taille d'infarctus, facteur pronostique fondamental de morbi-mortalité. Cependant, la reperfusion engendre des lésions d'ischémie-reperfusion (IR) irréversibles qui précipitent la mort par apoptose des cardiomyocytes. Une approche transcriptomique nous a permis d'identifier les gènes spécifiques du postconditionnement ischémique (PostC) dans le cœur de souris. Parmi ceux-ci, l'expression du gène codant pour le récepteur métabotrope de type 1 du glutamate (mGluR1) est augmentée par le PostC. L'objectif de mon travail de thèse a été d'étudier le rôle de mGluR1 au cours de l'IR myocardique. Notre stratégie, basée sur l'utilisation de souris knock-out, a permis de confirmer l'implication de mGluR1 dans la cardioprotection. L'injection de glutamate au moment de la reperfusion myocardique permet de diminuer significativement la taille de l'infarctus par inhibition de l'apoptose. Cet effet cardioprotecteur est diminué en présence de l'antagoniste spécifique YM 298198 ou en présence de wortmannin, inhibiteur de la PI3-kinase, activée dans la cascade de signalisation du récepteur. La réduction de la taille d'infarctus par le glutamate semble associée à une amélioration de la fonction contractile du ventricule gauche en échocardiographie (par speckle tracking, méthode de quantification de la déformation myocardique) dans un modèle murin d'IR myocardique. Ces résultats, bien que préliminaires, semblent prometteurs et nous permettent d'envisager une application clinique chez le patient coronarien. / Myocardial infarction is the major cause of cardiovascular mortality in western countries. Reperfusion as early as possible is the only treatment recognized to reduce infarct size, crucial prognostic factor of morbidity and mortality. However, reperfusion leads to ischemia-reperfusion (IR) injury leading to irreversible apoptotic death of cardiomyocytes. A transcriptomic approach has allowed us to identify genes specifically regulated upon ischemic postconditioning (PostC) in the mouse heart. Among them, the expression of the metabotropic glutamate receptor type 1 (mGluR1) gene is up-regulated by PostC. The aim of my thesis work was to study the role of mGluR1 during myocardial IR. Our strategy, based on the use of knockout mice, confirmed the involvement of mGluR1 in cardioprotection. Injection of glutamate at the time of reperfusion significantly reduced infarct size via apoptosis inhibition. This cardioprotective effect was reduced in presence of the specific antagonist YM 298198 or in presence of wortmannin, an inhibitor of PI3-kinase, which is activated downstream mGluR1. In our mouse model of myocardial IR injury, decrease in infarct size after glutamate treatment seems to be associated to an improved left ventricular contractile function assessed by echocardiography (speckle tracking method quantifying myocardial strain). These preliminary results are promising and allow us to consider a clinical trial for coronary patients.

Dans ce travail, nous avons montré qu'un nouveau ligand du TSPO, le TRO40303, possède des propriétés cardioprotectrices, confirmant que le TSPO joue un rôle important dans les effets délétères engendrés par l'ischémie-reperfusion myocardique. Des effets similaires ont déjà été observés avec d'autres ligands du TSPO, notamment le 4'-chlorodiazépam, mais le mécanisme d'action par lequel ces molécules exercent leur effet cardioprotecteur reste pour une large part encore mal connu. Nous avons montré chez le rat que la reperfusion d'un myocarde ischémié s'accompagne d'une augmentation du cholestérol mitochondrial, de la formation d'oxystérols et d'un stress oxydant majeur. Le 4'-chlorodiazépam inhibe ces effets et améliore les fonctions mitochondriales post-ischémiques, révélant que le TSPO est responsable du transport du cholestérol dans la mitochondrie cardiaque et que ce dernier, sous des formes oxydées ou non, pourrait participer aux effets délétères de la reperfusion. La limitation de l'entrée du cholestérol dans la mitochondrie lors de la reperfusion d'un myocarde ischémié est un mécanisme original qui pourrait donc contribuer à l'effet cardioprotecteur des ligands du TSPO. Enfin, nous avons montré que chez des rats génétiquement modifiés et associant hypercholestérolémie, obésité et diabète de type II, le cholestérol mitochondrial est d'une part très élevé, avec ou sans ischémie-reperfusion myocardique et d'autre part que le 4'-chlorodiazépam n'a pas d'effet sur le cholestérol mitochondrial après ischémie-reperfusion. Ces résultats suggèrent que les mécanismes d'action des ligands du TSPO sont probablement différents et que les traitements doivent être adaptés en présence de facteurs de co-morbidité. / In the present work we showed that a new TSPO ligand, TRO40303, has cardioprotective properties confirming that TSPO plays a key role in the deleterious effects of myocardial ischemia-reperfusion. Similar effects have been observed with other TSPO ligands, such as 4'-chlorodiazepam, but the mechanism of action of these molecules is not known. We showed that ischemia-reperfusion in rats increased mitochondrial concentration of cholesterol, oxysterol formation and oxidative stress. 4'-Chlorodiazepam inhibited these effects and improved post-ischemic mitochondrial functions, revealing that TSPO is responsible for cholesterol transport in cardiac mitochondria and that cholesterol, in oxidized or non-oxidized forms, could participate in the deleterious effects of reperfusion. The limitation of the increase in cholesterol in mitochondria during ischemia-reperfusion is an original mechanism which could contribute to the cardioprotective effect of TSPO ligands. We then showed, in genetically modified rats with hypercholesterolemia, obesity and type II diabetes, that the concentration of mitochondrial cholesterol is very high with or without ischemia-reperfusion. We further demonstrated that 4'-chlorodiazepam has no effect on mitochondrial cholesterol after ischemia-reperfusion. These results suggest that the mechanisms of action of TSPO ligands probably differ in these conditions and that treatment must be adapted in accordance with the presence of factors of co-morbidity.

Les objectifs de ce travail expérimental étaient : 1. Évaluer la place de la lactatémie capillaire comme dispositif de monitorage de l’ischémie et de la reperfusion tissulaire. 2. Comparer le suivi local du taux de lactate, au niveau du compartiment ischémié, par rapport au taux systémique du lactate lors des l’ischémie de membre, l’ischémie intestinale ainsi que durant le choc hémorragique. La mesure capillaire du taux de lactate pourrait permettre: 1. d’affirmer l’existence d’une ischémie tissulaire régionale. Le taux systémique du lactate ne permet ce diagnostic, 2. de confirmer l’efficacité d’une reperfusion au niveau d’un membre préalablement ischémique tandis que la mesure systémique des lactates ne le permet pas. L’affirmation de l’efficacité de la reperfusion et de sa constance, par une mesure aussi simple que la lactatémie capillaire compartimentale représente une avancée majeure en comparaison avec les autres méthodes existantes. La mesure capillaire du taux de lactate systémique dans une situation d’hypoperfusion par choc hémorragique n’est pas associée à augmentation du taux de lactate intra-musculaire. / Our objectives for this experimental work were: 1. Assessment of capillary lactate for tissue ischemia and reperfusion monitoring. 2. Compare the local and systemic capillary lactate time course during compartmental ischemia insults like limb ischemia, intestinal ischemia or during hemorrhagic shock. The capillary measurement of the lactate in IR could be interesting for: 1. Assessing a limb or intestinal tissue ischemia. On the opposite, the systemic measurement could not assess this diagnosis. 2. Assessing the efficiency of a limb reperfusion. On the opposite, the systemic measurement could not assess this diagnosis. The systemic capillary lactate measurement during haemorrhagic shock related hypo perfusion could not be associated with an increase in intra muscular lactate.

Introduction: La lésion d'ischémie - reperfusion (I/R) intestinale est associée à une mortalité élevée.Le rôle de la transmigration des neutrophiles est probablement essentiel dans le dysfonctionnement de la barrière induit par la lésion I/R et la nécrose subséquente. Le but de notre étude était d'évaluer, au niveau pré-clinique, la valeur thérapeutique potentielle du peptide P8RI (un agoniste de CD31) dans la lésion I/R de l'intestine grêle.Méthodes: I/R intestinale a été induite chez des rats Wistar par clampage de l'artère mésentérique supérieure (AMS) pendant 30 min suivi par 4 h de reperfusion. Trois groupes de rats ont été comparés:P8RI (n = 20, I/R et P8RI 2,5 mg/kg/h de reperfusion), I/R témoins positifs (n = 21, I/R et infusion de sérum physiologique) et témoins (n = 14, dissection de l'AMS sans clampage et infusion de sérum physiologique). La matrix métallopeptidase 9 (MMP-9) dans la plasma, le liquide péritonéal et l'intestin; la MPO intestinale, l'ADN libre plasmatique, les taux d'hémoglobine intraluminale e tl'épaisseur épithéliale ont été évalués comme marqueurs intermédiaires de la lésion intestinale. La détection du matériel génétique d'E.coli par PCR quantitative dans le sang a été également réalisée chez les témoins positifs et chez les rats traités par P8RI pendant la période de reperfusion. Le CD31clivé dans le plasma a été mesuré par une méthode d'ELISA maison. Résultats: La grade histologique de l'intestin grêle chez les animaux traités par P8RI est supérieur àcelui des témoins positifs d'I/R (p < 0,05). P8RI protège l'intestin grêle contre la destruction épithéliale induite par lésion I/R (p < 0,01). Il y a une corrélation négative significative entre l'abrasion épithéliale et le score de Chiu de classement histologique de la lésion I/R mésentérique (r = -0,7245, p < 0.001).P8RI protège l'intestin grêle de la MPO in situ, de la libération de la MMP-9 (p < 0,05) et des complications hémorragiques digestives causées par lésion I/R (p < 0,01). Les taux plasmatiques et péritonéaux accrus de MMP-9, induits par I/R, sont significativement réduits par P8RI (p < 0,05 et p <0,01, respectivement). L'ADN d'E.coli circulant est significativement plus élevé chez les rats de témoins positifs que dans le groupe P8RI (p < 0,05). L'ADN libre plasmatique pendant la reperfusion chez les rats de témoins positifs augmente significativement plus que celle des rats du groupe P8RI (p< 0,05). P8RI n'a aucun effet sur le compte neutrophilaire sanguin, mais induit une diminution significative de CD31 clivé dans le plasma pendant l'I/R mésentérique (p < 0,01). Les corrélations entre l'abrasion épithéliale et l'ADN libre, MMP-9, CD31 clivé plasmatiques, les taux de MMP-9 et MPO intestinale suggèrent que le mécanisme protecteur de P8RI implique l'inhibition de l'activation neutrophilaire, y compris le clivage de CD31. Conclusions: Cette étude suggère que le traitement par le peptide P8RI, un agoniste de CD31, réduit de la façon préventive, la lésion I/R de l'intestin grêle chez les rats. / Background: Intestinal ischemia/reperfusion (I/R) injury is associated with a high mortality. The roleof transmigration of PMNs is probably essential in I/R-induced intestinal barrier dysfunction andsubsequent necrosis. The aim of this study was to evaluate, at a preclinical level, the potentialtherapeutic value of P8RI peptide (a CD31 agonist), in small bowel I/R injury.Methods: Intestinal I/R was induced in Wistar rats by superior mesenteric artery (SMA) clamping for30 min followed by 4 h of reperfusion. Three groups of rats were compared: P8RI (n=20, I/R and P8RI2.5mg/kg/h infusion), I/R positive controls (n=21, I/R and normal saline infusion), and sham operatednegative controls (n=14, SMA dissection with no clamping and normal saline infusion). Plasma,peritoneal fluid and intestinal matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), intestinal MPO, plasma cf-DNA,intraluminal hemoglobin levels and epithelial thickness were all evaluated as intermediate markers ofintestinal injury. Detection of E.coli genetic material by quantitative PCR in blood was also performedin I/R controls and P8RI-treated rats during the reperfusion period. Plasma cleaved CD31 wasmeasured by homemade ELISA.Results: The small bowel histologic grade in P8RI-treated animals was higher than in I/R controls (p <0.05). P8RI protected against epithelial destruction induced by I/R injury (p < 0.01). There was asignificant negative correlation between epithelial abrasion and Chiu's score of histologic grading ofmesenteric I/R injury (r = -0.7245, p < 0.001). P8RI protected the small bowel from in situ MPO andMMP-9 release (p < 0.05) and digestive bleeding complications due to I/R injury (p < 0.01). Theincreased plasma and peritoneal MMP-9 levels induced by I/R were significantly reduced by P8RI (p <0.05 and p < 0.01, respectively). Plasma cf-DNA during reperfusion in I/R controls increasedsignificantly more than in the P8RI group (p < 0.05). E.coli DNA was significantly higher in I/Rcontrols than in the P8RI group (p < 0.05). P8RI had no effect on blood neutrophil counts but induceda significant diminution of cleaved CD31 in plasma during mesenteric I/R (p < 0.01). Correlationsbetween epithelial abrasion and plasma cf-DNA, MMP-9, cleaved CD31, intestinal MMP-9 and MPOlevels suggest that the protective mechanism of P8RI might involve the inhibition of neutrophilactivation, including CD31 cleavage.Conclusions: This study suggests that a treatment by P8RI peptide, a CD31 agonist, reduces smallbowel I/R injury in rats

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'infarctus du myocarde (IDM) est consécutif à une occlusion coronaire provoquant une ischémie prolongée. La taille de l'infarctus est le déterminant majeur de la récupération du myocarde et de la survie du patient. La reperfusion coronaire la plus précoce (par thrombolyse ou angioplastie) est reconnue comme étant le seul traitement recommandé. Cependant, malgré les effets bénéfiques, la reperfusion s'accompagne d'effets délétères appelés « lésions de reperfusion ». Récemment, l'efficacité du postconditionnement ischémique (PostC) a été démontrée en clinique. Il permet, lorsqu'il est utilisé au cours de l'angioplastie primaire ou de sauvetage, de réduire significativement la taille de l'infarctus. L'application du protocole de PostC reste cependant limitée aux patients admis dans les centres d'angioplastie, ce qui exclut tous les patients thrombolysés. Afin d'améliorer la cardioprotection, il est nécessaire de déterminer la fenêtre thérapeutique temporelle optimale d'administration du PostC. De plus, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques nouvelles, adjuvants de la reperfusion, qui pourront être administrées dès que le diagnostic d'IDM est posé. L'objectif de notre travail a donc été d'étudier l'influence du délai d'application du PostC sur l'efficacité de cardioprotection dans un modèle murin d'ischémie-reperfusion et de rechercher des substances pharmacologiques cardioprotectrices. Nos travaux révèlent que l'efficacité du PostC est maintenue s'il est appliqué les 30 premières minutes après le début de la reperfusion. D'autre part, nous avons évalué le potentiel thérapeutique de peptides inhibiteurs ciblant l'apoptose responsable de la mort cellulaire au cours de l'ischémie-reperfusion. L'utilisation de peptides Tat-BH4 et Pip2b-BH4 pour le traitement des lésions d'ischémie-reperfusion myocardique a fait l'objet d'une étude preuve-de-concept in vivo. Les constructions peptidiques inhibant l'interaction FAS-DAXX, injectées en intraveineuse au moment de la reperfusion, induisent une diminution de 50% de la taille d'infarctus et de l'apoptose. Ils ont fait l'objet d'un dépôt de brevet car ils constituent des outils pharmacologiques à haut potentiel thérapeutique. / Myocardial infarction (MI) results from a coronary occlusion leading to severe ischemia. Infarct size is a major determinant of myocardial salvage and mortality. Prompt revascularization (either by thrombolysis or primary angioplasty) is recommended for AMI patients but leads to deleterious effects called "reperfusion injury". Recently, ischemic postconditioning (PostC) efficiency has been reported in patients. However, its application during primary angioplasty is limited to patients admitted in angioplasty centers thereby excluding thrombolysed patients. In order to improve cardioprotection, it is necessary to define the time window for optimal cardioprotection and to develop new pharmacological strategies for AMI patients. Our work, using an in vivo mouse model of ischemia-reperfusion, shows that PostC efficiency is maintained if applied the first 30 minutes after the onset of reperfusion. Furthermore, we evaluated the therapeutic potential of peptide inhibitors targeting apoptosis, which is responsible for cell death during ischemia-reperfusion. As a proof-of-concept study, the cardioprotective effects of Tat-BH4 and Pip2b-BH4 peptidic constructs have been revealed in vitro and in vivo. The peptidic constructs targeting FAS-DAXX interaction, injected intravenously as a single bolus at the time of reperfusion, reduced by 50% both infarct size and apoptosis. These pharmacological tools have been patented due to their high therapeutic potential.

Les flavonoïdes sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, qui sont étudiés depuis de nombreuses années pour leur caractère antioxydant ainsi que leurs propriétés thérapeutique. La mise en évidence, pour certaines d’entre eux, d’une activité vasorelaxante variant en fonction de leur structure, en fait un modèle d’étude de choix pour la prévention des maladies cardiovasculaires. Le 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) est le dérivé le plus décrit pour son fort potentiel en terme de propriétés cardioprotectrices et antioxydantes et est considéré comme un composé d’intérêt dans le traitement anti-ischémique, bien que sa faible solubilité dans l’eau soit un facteur limitant pour son utilisation. Dans ce contexte, notre premier objectif a été de synthétiser une trentaine de dérivés du DiOHF, fonctionnalisés par un groupement hydrophile, tout en préservant ses propriétés antioxydantes et pour certaines des structures obtenues, ses propriétés vasorelaxantes. Pour cela, nous avons développé une méthode de synthèse rapide utilisant les irradiations micro-onde, qui nous a permis d’optimiser les rendements, de réduire les temps de réaction et qui ne conduit à aucune formation de sous-produits. Notre second objectif a été de déterminer l’activité antioxydante de ces dérivés flavonoïques par des tests mettant en œuvre des réactions de compétition avec des radicaux libres. Faisant suite à ce premier screening, des études biologiques chez le rat ont été réalisées sur les composés montrant les meilleures performances. A partir d’essais in vitro et in vivo nous avons démontré, l’innocuité de ces dérivés flavonols, et le fort impact des modifications de structure sur l’activité vasorelaxante et antioxydante, ainsi que sur la récupération fonctionnelle et métabolique consécutive à une ischémie/reperfusion myocardique. Un autre champ d’action de ces flavonols hydrosolubles pourrait être d’explorer leur utilisation dans le traitement du diabète de type 2. Pour cela nous avons greffé deux motifs antidiabétiques, correspondant à des molécules actives déjà utilisées dans le traitement de l’insulinorésistance, sur les dérivés flavonols les plus cardioprotecteurs et/ou vasorelaxants de notre série, ainsi que sur des dérivés de l’acide cinnamique. Ces composés ont été testés pour leur activité antioxydante, laissant supposer un potentiel significativement supérieur aux analogues antidiabétiques non fonctionnalisés, en termes de protection antioxydante et fonctionnelle. / Flavonoids are natural polyphenolic compounds, and epidemiological and pharmacological studies have shown that flavonoids intake is associated with many beneficial effects. An important example is the 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) which showed interesting therapeutic properties in vitro so it could be considered as an important lead compound to the treatment of cardiovascular diseases. However is poor water solubility prevents it use as a drug. Starting from this model we have synthesized a series of new flavones functionalized by a hydrophilic group in order to increase water solubility. To obtain these derivatives we have set up a fast, simple and clean method without formation of by-products, using micro-waves irradiation to optimize yield and to decrease reaction time. Our second purpose was to investigate the antioxidant activity of the synthesized compounds by undergoing several assays. The most promising compounds were tested in biological studies, in vitro and in vivo. The results showed a significant enhancement of the post-ischemic mechanical function recovery in vivo and in vitro. Another purpose was to designed new flavonols linked to selected antidiabetic moieties already used in the treatment of insulinoresistance. It was shown that these new compounds retain the antioxidant properties of the parent flavonols, and can be of interest in the development of new diabete 2 treatments.

Le système kallicréine-kinines (SKK) est un système peptidique vasodilatateur. Les métabolites actifs du système, les kinines, sont produites par la kallicréine tissulaire (TK), et agissent via leurs deux récepteurs, B2 et B1. Le SKK a été impliqué dans les processus physiopathologiques conduisant au diabète de type 2. Son rôle est bien établi dans la protection des complications cardiovasculaires et rénales du diabète. Nous avons étudié le rôle du SKK dans le développement des anomalies métaboliques liées à l'obésité en utilisant des souris déficientes en TK dans deux modèles d'obésité (mutation ob/ob et régime gras). Nous n'avons pas mis en évidence d'effet de la déficience en TK sur les anomalies glucidiques dans ces deux modèles. Chez l'homme, nous avons étudié l'effet d'un polymorphisme génétique de la TK dans une cohorte de 4843 sujets de la population générale suivi pendant 9 ans. Nous n'avons pas observé d'effet d'un déficit partiel en activité TK sur l'apparition des troubles glucidiques.Ensuite, nous avons étudié l'effet de la stimulation du SKK par des agonistes spécifiques de chaque récepteur lors d'une ischémie reperfusion cardiaque. Chez les souris non diabétiques, l'agoniste B2 réduit la taille de l'infarctus. L'agoniste B1 n'a pas d'effet. Chez les souris diabétiques, l'agoniste B2 n'a pas d'effet. En revanche, l'agoniste B1 diminue la taille de l'infarctus. On observe une induction de la synthèse du B1R dans le c¿ur diabétique.Nos travaux clarifient le rôle du SKK dans le développement du diabète et de ses complications cardiaques. L'effet des agonistes ouvre une nouvelle piste thérapeutique dans la prise en charge des du syndrome coronarien aigu. / Kallikrein-kinin system (KKS) is a vasodilator peptide system. Kinins, the active peptides, are produced by tissue kallikrein (TK), and act via their two receptors, B1 and B2. KKS was involved in the pathophysiological process leading to type 2 diabetes. Its role is well established in the protection of cardiovascular and renal complications of diabetes. We studied the role of SKK in the development of metabolic abnormalities associated with obesity using TK deficient mice in two models of obesity (Ob/Ob and high fat diet). We did not observed any effect of TK deficiency on metabolic parameters in these two models. In humans, we studied the effect of a polymorphism of TK in a population-based cohort of 4843 subjects followed for 9 years. We did not observe any effect of a partial deficiency in TK on the occurrence of metabolic disorders. Next, we studied the effect of specific agonists of B1 and B2 receptors in cardiac ischemia reperfusion injury. In non-diabetic mice, the B2 agonist reduces infarct size. Agonist B1 has no effect. In diabetic mice, B2 agonist had no effect. In contrast, B1 agonist reduces infarct size. Overexpression of B1R is observed in the diabetic heart. Our work clarifies the role of SKK in the development of diabetes and its cardiac complications. Agonists of kinins receptors could be a new therapeutic approach in the management of acute coronary syndrome.