Recentes estudos têm vinculado a ingestão de dietas à base de proteína de soja com a redução de fatores de risco para doenças cardiovasculares. Esse efeito vem sendo diretamente relacionado às isoflavonas da soja, encontradas principalmente sob as formas genisteína, daidzeína e gliciteína. Um dos objetivos deste estudo foi analisar o conteúdo de isoflavonas em dois produtos derivados da soja e sua ef icácia como antioxidantes in vitro e investigamos, também, o efeito in vivo do tratamento com dieta à base de proteína de soja, durante 9 semanas, em ratos submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio. O conteúdo de isoflavonas foi analisado no gérmen de soja (GS) e na proteína isolada de soja (PIS) através de HPLC. A qualidade e a quantidade de antioxidantes presentes nas amostras foram quantif icadas pelos métodos de reatividade antioxidante total (TAR) e de capacidade antioxidante total (TRAP). Foi analisado o poder antioxidante do GS e da PIS medindo-se o percentual de inibição da lipoperoxidação (LPO) pelo método de TBA-RS em homogeneizado de fígado de ratos submetidos a um sistema gerador de radicais livres in vitro. Identif icamos que o GS apresentou 9 vezes mais quantidade de daidzina do que a PIS que, por sua vez, apresentou 4,5 vezes mais quantidade de genisteína do que o GS. O GS mostrou reatividade antioxidante total três vezes maior do que a PIS, mas ambos os produtos apresentaram os mesmos níveis de antioxidantes. Os dois produtos inibiram a LPO na mesma proporção (81% e 79%, para GS e PIS, respectivamente). Na investigação in vivo, foram utilizados ratos Wistar machos que receberam água e dieta contendo PIS ou caseína (17% de proteína) ad libitum , a partir da 3ª semana até a 12ª semana de vida, subdivididos em 6 grupos: Caseína Controle: submetidos à cirurgia f ictícia de infarto do miocárdio, alimentados com dieta à base de caseína. Caseína Infarto<25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto inferior a 25%, alimentados com dieta à base de caseína. Caseína Infarto>25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto superior a 25%, alimentados com dieta à base de caseína. Soja Controle: submetidos à cirurgia f ictícia de infarto do miocárdio, alimentados com dieta à base de PIS. Soja Infarto<25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto inferior a 25%, alimentados com dieta à base de PIS. Soja Infarto>25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto superior a 25%, alimentados com dieta à base de PIS. A cirurgia de infarto foi realizada na quinta semana de tratamento e, quatro semanas após a cirurgia, os animais foram submetidos ao cateterismo cardíaco para avaliação hemodinâmica da pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), pressão diastólica f inal do ventrículo esquerdo (PDFVE), índices de contratilidade e relaxamento (+dP/dt) e a pressão aórtica média (PAM). Imediatamente após a avaliação hemodinâmica, os animais foram sacrif icados por decapitação, o coração foi extraído e determinada a área de infarto. O fígado, os pulmões e o tecido adiposo abdominal (gordura perirrenal, epididimal e mesentérica) e tecido adiposo marrom (da região interescapular) foram dissecados e pesados e o nível de congestão hepática e pulmonar determinado. Foram coletadas amostras de sangue para a realização das medidas de concentração plasmática de nitritos e nitratos, e em eritrócitos foram feitas medidas de lipoperoxidação (LPO) e de enzimas antioxidantes: catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx). Em homogeneizado de músculo cardíaco, foram realizadas as técnicas de determinação da quimiluminescência (QL), da concentração de carbonilas e da atividade das enzimas: CAT, SOD e GPx. Os animais infartados alimentados com caseína apresentaram hipertrof ia cardíaca, congestão hepática e pulmonar, aumento da PDFVE e da –dP/dt, diminuição da PSVE, +dP/dt e da PAM, sinais típicos de Insuf iciência Cardíaca (IC). A dieta à base de PIS foi capaz de prevenir a congestão pulmonar nos dois grupos infartados e prevenir a congestão hepática no grupo SI<25%, melhorar a função ventricular sistólica e diastólica e diminuir o estresse oxidativo cardíaco e sistêmico dos ratos infartados. A disfunção ventricular foi correlacionada com o aumento do dano oxidativo no miocárdio como mostram os resultados de QL e de concentração de carbonilas (aumento de 3 e 10 vezes, respectivamente) nos grupos infartados. Verif icamos que os ratos alimentados com PIS apresentaram maior atividade das enzimas antioxidantes no miocárdio do que os animais alimentados com caseína, a SOD aumentou 72% e a CAT e a GPx em 24% e a QL diminuiu. No plasma, a alimentação à base de PIS aumentou os níveis de nitritos e nitratos e, em eritrócitos, aumentou a atividade das enzimas antioxidantes quando comparada à alimentação à base de caseína. Este trabalho demonstra, pela primeira vez, uma melhora da função ventricular pós-infarto do miocárdio, evitando a progressão ao estágio de IC severa, pela administração dietética de PIS de forma preventiva.

Recentes estudos têm vinculado a ingestão de dietas à base de proteína de soja com a redução de fatores de risco para doenças cardiovasculares. Esse efeito vem sendo diretamente relacionado às isoflavonas da soja, encontradas principalmente sob as formas genisteína, daidzeína e gliciteína. Um dos objetivos deste estudo foi analisar o conteúdo de isoflavonas em dois produtos derivados da soja e sua ef icácia como antioxidantes in vitro e investigamos, também, o efeito in vivo do tratamento com dieta à base de proteína de soja, durante 9 semanas, em ratos submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio. O conteúdo de isoflavonas foi analisado no gérmen de soja (GS) e na proteína isolada de soja (PIS) através de HPLC. A qualidade e a quantidade de antioxidantes presentes nas amostras foram quantif icadas pelos métodos de reatividade antioxidante total (TAR) e de capacidade antioxidante total (TRAP). Foi analisado o poder antioxidante do GS e da PIS medindo-se o percentual de inibição da lipoperoxidação (LPO) pelo método de TBA-RS em homogeneizado de fígado de ratos submetidos a um sistema gerador de radicais livres in vitro. Identif icamos que o GS apresentou 9 vezes mais quantidade de daidzina do que a PIS que, por sua vez, apresentou 4,5 vezes mais quantidade de genisteína do que o GS. O GS mostrou reatividade antioxidante total três vezes maior do que a PIS, mas ambos os produtos apresentaram os mesmos níveis de antioxidantes. Os dois produtos inibiram a LPO na mesma proporção (81% e 79%, para GS e PIS, respectivamente). Na investigação in vivo, foram utilizados ratos Wistar machos que receberam água e dieta contendo PIS ou caseína (17% de proteína) ad libitum , a partir da 3ª semana até a 12ª semana de vida, subdivididos em 6 grupos: Caseína Controle: submetidos à cirurgia f ictícia de infarto do miocárdio, alimentados com dieta à base de caseína. Caseína Infarto<25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto inferior a 25%, alimentados com dieta à base de caseína. Caseína Infarto>25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto superior a 25%, alimentados com dieta à base de caseína. Soja Controle: submetidos à cirurgia f ictícia de infarto do miocárdio, alimentados com dieta à base de PIS. Soja Infarto<25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto inferior a 25%, alimentados com dieta à base de PIS. Soja Infarto>25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto superior a 25%, alimentados com dieta à base de PIS. A cirurgia de infarto foi realizada na quinta semana de tratamento e, quatro semanas após a cirurgia, os animais foram submetidos ao cateterismo cardíaco para avaliação hemodinâmica da pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), pressão diastólica f inal do ventrículo esquerdo (PDFVE), índices de contratilidade e relaxamento (+dP/dt) e a pressão aórtica média (PAM). Imediatamente após a avaliação hemodinâmica, os animais foram sacrif icados por decapitação, o coração foi extraído e determinada a área de infarto. O fígado, os pulmões e o tecido adiposo abdominal (gordura perirrenal, epididimal e mesentérica) e tecido adiposo marrom (da região interescapular) foram dissecados e pesados e o nível de congestão hepática e pulmonar determinado. Foram coletadas amostras de sangue para a realização das medidas de concentração plasmática de nitritos e nitratos, e em eritrócitos foram feitas medidas de lipoperoxidação (LPO) e de enzimas antioxidantes: catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx). Em homogeneizado de músculo cardíaco, foram realizadas as técnicas de determinação da quimiluminescência (QL), da concentração de carbonilas e da atividade das enzimas: CAT, SOD e GPx. Os animais infartados alimentados com caseína apresentaram hipertrof ia cardíaca, congestão hepática e pulmonar, aumento da PDFVE e da –dP/dt, diminuição da PSVE, +dP/dt e da PAM, sinais típicos de Insuf iciência Cardíaca (IC). A dieta à base de PIS foi capaz de prevenir a congestão pulmonar nos dois grupos infartados e prevenir a congestão hepática no grupo SI<25%, melhorar a função ventricular sistólica e diastólica e diminuir o estresse oxidativo cardíaco e sistêmico dos ratos infartados. A disfunção ventricular foi correlacionada com o aumento do dano oxidativo no miocárdio como mostram os resultados de QL e de concentração de carbonilas (aumento de 3 e 10 vezes, respectivamente) nos grupos infartados. Verif icamos que os ratos alimentados com PIS apresentaram maior atividade das enzimas antioxidantes no miocárdio do que os animais alimentados com caseína, a SOD aumentou 72% e a CAT e a GPx em 24% e a QL diminuiu. No plasma, a alimentação à base de PIS aumentou os níveis de nitritos e nitratos e, em eritrócitos, aumentou a atividade das enzimas antioxidantes quando comparada à alimentação à base de caseína. Este trabalho demonstra, pela primeira vez, uma melhora da função ventricular pós-infarto do miocárdio, evitando a progressão ao estágio de IC severa, pela administração dietética de PIS de forma preventiva.

Recentes estudos têm vinculado a ingestão de dietas à base de proteína de soja com a redução de fatores de risco para doenças cardiovasculares. Esse efeito vem sendo diretamente relacionado às isoflavonas da soja, encontradas principalmente sob as formas genisteína, daidzeína e gliciteína. Um dos objetivos deste estudo foi analisar o conteúdo de isoflavonas em dois produtos derivados da soja e sua ef icácia como antioxidantes in vitro e investigamos, também, o efeito in vivo do tratamento com dieta à base de proteína de soja, durante 9 semanas, em ratos submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio. O conteúdo de isoflavonas foi analisado no gérmen de soja (GS) e na proteína isolada de soja (PIS) através de HPLC. A qualidade e a quantidade de antioxidantes presentes nas amostras foram quantif icadas pelos métodos de reatividade antioxidante total (TAR) e de capacidade antioxidante total (TRAP). Foi analisado o poder antioxidante do GS e da PIS medindo-se o percentual de inibição da lipoperoxidação (LPO) pelo método de TBA-RS em homogeneizado de fígado de ratos submetidos a um sistema gerador de radicais livres in vitro. Identif icamos que o GS apresentou 9 vezes mais quantidade de daidzina do que a PIS que, por sua vez, apresentou 4,5 vezes mais quantidade de genisteína do que o GS. O GS mostrou reatividade antioxidante total três vezes maior do que a PIS, mas ambos os produtos apresentaram os mesmos níveis de antioxidantes. Os dois produtos inibiram a LPO na mesma proporção (81% e 79%, para GS e PIS, respectivamente). Na investigação in vivo, foram utilizados ratos Wistar machos que receberam água e dieta contendo PIS ou caseína (17% de proteína) ad libitum , a partir da 3ª semana até a 12ª semana de vida, subdivididos em 6 grupos: Caseína Controle: submetidos à cirurgia f ictícia de infarto do miocárdio, alimentados com dieta à base de caseína. Caseína Infarto<25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto inferior a 25%, alimentados com dieta à base de caseína. Caseína Infarto>25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto superior a 25%, alimentados com dieta à base de caseína. Soja Controle: submetidos à cirurgia f ictícia de infarto do miocárdio, alimentados com dieta à base de PIS. Soja Infarto<25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto inferior a 25%, alimentados com dieta à base de PIS. Soja Infarto>25%: submetidos ao modelo animal de infarto do miocárdio, com área de infarto superior a 25%, alimentados com dieta à base de PIS. A cirurgia de infarto foi realizada na quinta semana de tratamento e, quatro semanas após a cirurgia, os animais foram submetidos ao cateterismo cardíaco para avaliação hemodinâmica da pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE), pressão diastólica f inal do ventrículo esquerdo (PDFVE), índices de contratilidade e relaxamento (+dP/dt) e a pressão aórtica média (PAM). Imediatamente após a avaliação hemodinâmica, os animais foram sacrif icados por decapitação, o coração foi extraído e determinada a área de infarto. O fígado, os pulmões e o tecido adiposo abdominal (gordura perirrenal, epididimal e mesentérica) e tecido adiposo marrom (da região interescapular) foram dissecados e pesados e o nível de congestão hepática e pulmonar determinado. Foram coletadas amostras de sangue para a realização das medidas de concentração plasmática de nitritos e nitratos, e em eritrócitos foram feitas medidas de lipoperoxidação (LPO) e de enzimas antioxidantes: catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx). Em homogeneizado de músculo cardíaco, foram realizadas as técnicas de determinação da quimiluminescência (QL), da concentração de carbonilas e da atividade das enzimas: CAT, SOD e GPx. Os animais infartados alimentados com caseína apresentaram hipertrof ia cardíaca, congestão hepática e pulmonar, aumento da PDFVE e da –dP/dt, diminuição da PSVE, +dP/dt e da PAM, sinais típicos de Insuf iciência Cardíaca (IC). A dieta à base de PIS foi capaz de prevenir a congestão pulmonar nos dois grupos infartados e prevenir a congestão hepática no grupo SI<25%, melhorar a função ventricular sistólica e diastólica e diminuir o estresse oxidativo cardíaco e sistêmico dos ratos infartados. A disfunção ventricular foi correlacionada com o aumento do dano oxidativo no miocárdio como mostram os resultados de QL e de concentração de carbonilas (aumento de 3 e 10 vezes, respectivamente) nos grupos infartados. Verif icamos que os ratos alimentados com PIS apresentaram maior atividade das enzimas antioxidantes no miocárdio do que os animais alimentados com caseína, a SOD aumentou 72% e a CAT e a GPx em 24% e a QL diminuiu. No plasma, a alimentação à base de PIS aumentou os níveis de nitritos e nitratos e, em eritrócitos, aumentou a atividade das enzimas antioxidantes quando comparada à alimentação à base de caseína. Este trabalho demonstra, pela primeira vez, uma melhora da função ventricular pós-infarto do miocárdio, evitando a progressão ao estágio de IC severa, pela administração dietética de PIS de forma preventiva.

Isoflavonas são substâncias fenólicas conhecidas por promoverem diversos efeitos benéficos à pele. Na soja, esses compostos são essencialmente encontrados nas formas glicosiladas. No entanto, as atividades biológicas são principalmente relacionadas com as suas formas agliconas. A presente tese teve como principal objetivo a obtenção de uma fração enriquecida em isoflavonas agliconas e a sua incorporação em formulações tópicas visando o aumento da retenção cutânea de tais compostos. Para tanto, foi realizada primeiramente a extração de soja em meio hidroetanólico seguida de processo clássico hidrolítico (hidrólise ácida) para obtenção das formas livres das isoflavonas. O extrato obtido foi avaliado por um método cromatográfico de ultraeficiência, o qual foi desenvolvido e validado para a determinação quantitativa das isoflavonas agliconas (IA), bem como para avaliação das principais impurezas furânicas formadas. O método mostrou-se específico, linear, preciso, robusto e exato para a quantificação das IA daidzeína, gliciteína e genisteína, e para a quantificação das impurezas hidroximetilfurfural (HMF) e etoximetilfurfural (EMF). Além disso, o método foi concomitantemente validado para a quantificação das IA em diferentes matrizes analíticas e bioanalíticas visando estudos de desenvolvimento de produtos tópicos e estudos de permeação/retenção cutânea. Devido à toxicidade relatada na literatura para o HMF, o presente estudo investigou in vitro o potencial genotóxico e mutagênico do EMF, principal impureza formada após degradação ácida dos açúcares presentes no extrato hidroetanólico de soja. O EMF apresentou potencial genotóxico em linhagem celular do tipo HepG2 nas concentrações próximas ao teor encontrado no extrato. Devido a isso, foi realizada uma investigação de métodos alternativos ao da hidrólise ácida visando à obtenção das IA da soja sem a presença de HMF e EMF, e facilitando, desta forma, os processos de purificação até uma fração enriquecida em IA. Para tanto, foram realizadas otimizações de processos hidrolíticos mais seletivos, tais como hidrólise enzimática com β-glicosidase e fermentação com Saccharomyces cerevisiae. Os processos foram primeiramente avaliados por desenho experimental de Plackett-Burman para determinação dos principais fatores que podem influenciar durante os bioprocessos hidrolíticos. Posteriormente, os métodos foram otimizados por meio de desenho experimental de Box-Behnken. Destaca-se que os processos foram realizados com um extrato equivalente ao extraído de 1,0 g de soja desengordurada. Para o método enzimático, as condições ótimas de processo compreenderam 838 unidades de β-glicosidase, em pH 6.0, durante 4,5 h à 37 ºC. Para o método fermentativo, as condições ótimas de processo hidrolítico compreenderam 1500 mg de fermento comercial contendo Saccharomyces cerevisiae, em pH 7.6, durante 24 h à 33 ºC. Os extratos foram avaliados quanto ao teor de IA, sempre realizando a sua comparação com um extrato não hidrolisado (controle negativo) e com um extrato hidrolisado pela via ácida (controle positivo). O teor de IA após hidrólise enzimática foi estatisticamente semelhante ao controle positivo. No entanto, o processo de fermentação não permitiu completa hidrólise das isoflavonas, sendo necessária a realização de um processo adicional de hidrólise ácida ao final do processo fermentativo. Todos os extratos hidrolisados, ou seja, os obtidos pelas vias ácida, enzimática, fermentativa, fermentativa+ácida, foram avaliados quanto à presença ou ausência de açúcares, compostos furânicos, triterpenos e saponinas. Além disso, todos passaram por processo de partição líquido-líquido com acetato de etila para obtenção de diferentes frações. A fração que apresentou maior pureza e que foi considerada a mais promissora para escalonamento de produção foi obtida após partição do extrato de soja hidrolisado pela via enzimática. Essa fração foi avaliada quanto ao seu potencial in vitro de proliferação de queratinócitos (HaCaT). Após 48 h de tratamento celular, os resultados demonstraram que a fração na concentração de 0,1 μg de IA/mL foi considerada não citotóxica para as células e apresentou promissora atividade proliferativa de queratinócitos. Desta forma, tal fração foi escolhida para ser incorporada em nanoemulsões visando uma futura aplicação tópica durante processos regenerativos de tecidos cutâneos. As formulações foram espessadas, ou não, até hidrogéis de ácido hialurônico. Por fim, foi realizada a avaliação da capacidade de permeação/retenção cutânea das IA a partir das formulações utilizando modelo experimental in vitro com pele de orelha suína. Tanto as nanoemulsões quanto os hidrogéis demonstraram ser promissores sistemas de liberação das IA na pele, aumentando sua retenção em camadas cutâneas consideradas importantes para exercerem seus efeitos benéficos. / Isoflavones are phenolic compounds that promote several benefic effects on the skin. In soybeans, these substances are present in different chemical conformations, mostly as glycoside conjugates. However, the beneficial activities are mainly credited to their aglycone forms. The main goal of this study was the production of an isoflavone aglycone-rich fraction to be incorportated into topical products intended to increase the skin retention of isoflavone aglycones (IA). For that, firstly it was performed a soybean extraction in a hydroethanolic media followed by a classical hydrolysis procedure (acid hydrolysis) to breakdown the conjugated forms until their respective aglycones. To analyze the obtained extract, an ultra-fast liquid chromatography method was developed and validated. The method showed to be specific, linear, precise, robust and accurate for quantification of daidzein, glycitein and genistein, as well as for hydroxymethylfurfural (HMF) and ethoxymethylfurfural (EMF), the main impurities present in the acid hydrolyzed extract. Besides, the method was concomitantly validated for determination of IA in different analytical and bioanalytical matrices during development of topical products and permeation/retention assays. Due to the well-documented toxicity of HMF, this study also investigated in vitro the genotoxic and mutagenic potential of EMF, a sugar degradation product formed after acid hydrolysis of soybean extract. EMF showed to be genotoxic for HepG2 cells at concentrations very close to those present in the extract. So, alternative hydrolysis methods were carried out aiming to obtain the IA from soybeans without the presence of HMF and EMF, and thus facilitating the processes of purification until new IA-rich fractions. For that, procedures with more selectivity properties were accomplished, such as enzymatic hydrolysis with β-glucosidase and fermentation with Saccharomyces cerevisiae. These methods were firstly evaluated by a Plackett-Burman design, to screen the main factors that could be influencing during the hydrolysis of isoflavones present in soybean extract. Further, the methods were optimized by Box-Behnken design. It is important to highpoint that the processes were always carried out with a sample corresponding to the extracted from 1.0 g of defatted soybeans. The highest IA content was achieved under the optimal conditions: enzymatic hydrolysis with 838 units of β-glucosidase, during 4.5 h at pH 6.0 and 37 ºC, or fermentative process with 1500 mg of commercial bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) during 24 h at pH 7.6 and 33 ºC. The extracts were investigated to evaluate the IA content, and the results were always compared with a non-hydrolyzed extract (negative control) and with an acid hydrolyzed extract (positive control). The IA amount after enzymatic hydrolysis was statistically similar than positive control. However, the fermentation did not hydrolyze completely the isoflavones, being necessary an additional acid hydrolysis at end of fermentative process. The extracts obtained by acid, enzymatic, fermentative and fermentative+acid processes were investigated to analyze the presence or absence of sugars, furanic compounds, triterpenes and saponins. Besides, all of them were partitioned with ethyl acetate to obtain IA-rich fractions. The most pure and easily achieved fraction was the one obtained from enzymatic hydrolyzed extract. This fraction was examined to explore its in vitro proliferation ability in keratinocytes cells (HaCaT). After 48 h of cellular treatment, the results showed that the fraction at 0,1 μg de IA/mL was considered non-cytotoxic for cells, and showed a promising proliferative activity. Therefore, this fraction was chosen to be incorporated in nanoemulsions viewing a future topic application during regenerative processes of skin. Moreover, the formulations were thickened, or not, until hyaluronic acid hydrogels. Lastly, it was performed the skin permeation/retention evaluation for IA from formulations using an in vitro experimental model with porcine ear skin. Both nanoemulsions and hydrogels were considered as promisor delivery systems for IA, increasing their retention in skin layers (epidermis and dermis).

Isoflavonas são substâncias fenólicas conhecidas por promoverem diversos efeitos benéficos à pele. Na soja, esses compostos são essencialmente encontrados nas formas glicosiladas. No entanto, as atividades biológicas são principalmente relacionadas com as suas formas agliconas. A presente tese teve como principal objetivo a obtenção de uma fração enriquecida em isoflavonas agliconas e a sua incorporação em formulações tópicas visando o aumento da retenção cutânea de tais compostos. Para tanto, foi realizada primeiramente a extração de soja em meio hidroetanólico seguida de processo clássico hidrolítico (hidrólise ácida) para obtenção das formas livres das isoflavonas. O extrato obtido foi avaliado por um método cromatográfico de ultraeficiência, o qual foi desenvolvido e validado para a determinação quantitativa das isoflavonas agliconas (IA), bem como para avaliação das principais impurezas furânicas formadas. O método mostrou-se específico, linear, preciso, robusto e exato para a quantificação das IA daidzeína, gliciteína e genisteína, e para a quantificação das impurezas hidroximetilfurfural (HMF) e etoximetilfurfural (EMF). Além disso, o método foi concomitantemente validado para a quantificação das IA em diferentes matrizes analíticas e bioanalíticas visando estudos de desenvolvimento de produtos tópicos e estudos de permeação/retenção cutânea. Devido à toxicidade relatada na literatura para o HMF, o presente estudo investigou in vitro o potencial genotóxico e mutagênico do EMF, principal impureza formada após degradação ácida dos açúcares presentes no extrato hidroetanólico de soja. O EMF apresentou potencial genotóxico em linhagem celular do tipo HepG2 nas concentrações próximas ao teor encontrado no extrato. Devido a isso, foi realizada uma investigação de métodos alternativos ao da hidrólise ácida visando à obtenção das IA da soja sem a presença de HMF e EMF, e facilitando, desta forma, os processos de purificação até uma fração enriquecida em IA. Para tanto, foram realizadas otimizações de processos hidrolíticos mais seletivos, tais como hidrólise enzimática com β-glicosidase e fermentação com Saccharomyces cerevisiae. Os processos foram primeiramente avaliados por desenho experimental de Plackett-Burman para determinação dos principais fatores que podem influenciar durante os bioprocessos hidrolíticos. Posteriormente, os métodos foram otimizados por meio de desenho experimental de Box-Behnken. Destaca-se que os processos foram realizados com um extrato equivalente ao extraído de 1,0 g de soja desengordurada. Para o método enzimático, as condições ótimas de processo compreenderam 838 unidades de β-glicosidase, em pH 6.0, durante 4,5 h à 37 ºC. Para o método fermentativo, as condições ótimas de processo hidrolítico compreenderam 1500 mg de fermento comercial contendo Saccharomyces cerevisiae, em pH 7.6, durante 24 h à 33 ºC. Os extratos foram avaliados quanto ao teor de IA, sempre realizando a sua comparação com um extrato não hidrolisado (controle negativo) e com um extrato hidrolisado pela via ácida (controle positivo). O teor de IA após hidrólise enzimática foi estatisticamente semelhante ao controle positivo. No entanto, o processo de fermentação não permitiu completa hidrólise das isoflavonas, sendo necessária a realização de um processo adicional de hidrólise ácida ao final do processo fermentativo. Todos os extratos hidrolisados, ou seja, os obtidos pelas vias ácida, enzimática, fermentativa, fermentativa+ácida, foram avaliados quanto à presença ou ausência de açúcares, compostos furânicos, triterpenos e saponinas. Além disso, todos passaram por processo de partição líquido-líquido com acetato de etila para obtenção de diferentes frações. A fração que apresentou maior pureza e que foi considerada a mais promissora para escalonamento de produção foi obtida após partição do extrato de soja hidrolisado pela via enzimática. Essa fração foi avaliada quanto ao seu potencial in vitro de proliferação de queratinócitos (HaCaT). Após 48 h de tratamento celular, os resultados demonstraram que a fração na concentração de 0,1 μg de IA/mL foi considerada não citotóxica para as células e apresentou promissora atividade proliferativa de queratinócitos. Desta forma, tal fração foi escolhida para ser incorporada em nanoemulsões visando uma futura aplicação tópica durante processos regenerativos de tecidos cutâneos. As formulações foram espessadas, ou não, até hidrogéis de ácido hialurônico. Por fim, foi realizada a avaliação da capacidade de permeação/retenção cutânea das IA a partir das formulações utilizando modelo experimental in vitro com pele de orelha suína. Tanto as nanoemulsões quanto os hidrogéis demonstraram ser promissores sistemas de liberação das IA na pele, aumentando sua retenção em camadas cutâneas consideradas importantes para exercerem seus efeitos benéficos. / Isoflavones are phenolic compounds that promote several benefic effects on the skin. In soybeans, these substances are present in different chemical conformations, mostly as glycoside conjugates. However, the beneficial activities are mainly credited to their aglycone forms. The main goal of this study was the production of an isoflavone aglycone-rich fraction to be incorportated into topical products intended to increase the skin retention of isoflavone aglycones (IA). For that, firstly it was performed a soybean extraction in a hydroethanolic media followed by a classical hydrolysis procedure (acid hydrolysis) to breakdown the conjugated forms until their respective aglycones. To analyze the obtained extract, an ultra-fast liquid chromatography method was developed and validated. The method showed to be specific, linear, precise, robust and accurate for quantification of daidzein, glycitein and genistein, as well as for hydroxymethylfurfural (HMF) and ethoxymethylfurfural (EMF), the main impurities present in the acid hydrolyzed extract. Besides, the method was concomitantly validated for determination of IA in different analytical and bioanalytical matrices during development of topical products and permeation/retention assays. Due to the well-documented toxicity of HMF, this study also investigated in vitro the genotoxic and mutagenic potential of EMF, a sugar degradation product formed after acid hydrolysis of soybean extract. EMF showed to be genotoxic for HepG2 cells at concentrations very close to those present in the extract. So, alternative hydrolysis methods were carried out aiming to obtain the IA from soybeans without the presence of HMF and EMF, and thus facilitating the processes of purification until new IA-rich fractions. For that, procedures with more selectivity properties were accomplished, such as enzymatic hydrolysis with β-glucosidase and fermentation with Saccharomyces cerevisiae. These methods were firstly evaluated by a Plackett-Burman design, to screen the main factors that could be influencing during the hydrolysis of isoflavones present in soybean extract. Further, the methods were optimized by Box-Behnken design. It is important to highpoint that the processes were always carried out with a sample corresponding to the extracted from 1.0 g of defatted soybeans. The highest IA content was achieved under the optimal conditions: enzymatic hydrolysis with 838 units of β-glucosidase, during 4.5 h at pH 6.0 and 37 ºC, or fermentative process with 1500 mg of commercial bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) during 24 h at pH 7.6 and 33 ºC. The extracts were investigated to evaluate the IA content, and the results were always compared with a non-hydrolyzed extract (negative control) and with an acid hydrolyzed extract (positive control). The IA amount after enzymatic hydrolysis was statistically similar than positive control. However, the fermentation did not hydrolyze completely the isoflavones, being necessary an additional acid hydrolysis at end of fermentative process. The extracts obtained by acid, enzymatic, fermentative and fermentative+acid processes were investigated to analyze the presence or absence of sugars, furanic compounds, triterpenes and saponins. Besides, all of them were partitioned with ethyl acetate to obtain IA-rich fractions. The most pure and easily achieved fraction was the one obtained from enzymatic hydrolyzed extract. This fraction was examined to explore its in vitro proliferation ability in keratinocytes cells (HaCaT). After 48 h of cellular treatment, the results showed that the fraction at 0,1 μg de IA/mL was considered non-cytotoxic for cells, and showed a promising proliferative activity. Therefore, this fraction was chosen to be incorporated in nanoemulsions viewing a future topic application during regenerative processes of skin. Moreover, the formulations were thickened, or not, until hyaluronic acid hydrogels. Lastly, it was performed the skin permeation/retention evaluation for IA from formulations using an in vitro experimental model with porcine ear skin. Both nanoemulsions and hydrogels were considered as promisor delivery systems for IA, increasing their retention in skin layers (epidermis and dermis).

Isoflavonas são substâncias fenólicas conhecidas por promoverem diversos efeitos benéficos à pele. Na soja, esses compostos são essencialmente encontrados nas formas glicosiladas. No entanto, as atividades biológicas são principalmente relacionadas com as suas formas agliconas. A presente tese teve como principal objetivo a obtenção de uma fração enriquecida em isoflavonas agliconas e a sua incorporação em formulações tópicas visando o aumento da retenção cutânea de tais compostos. Para tanto, foi realizada primeiramente a extração de soja em meio hidroetanólico seguida de processo clássico hidrolítico (hidrólise ácida) para obtenção das formas livres das isoflavonas. O extrato obtido foi avaliado por um método cromatográfico de ultraeficiência, o qual foi desenvolvido e validado para a determinação quantitativa das isoflavonas agliconas (IA), bem como para avaliação das principais impurezas furânicas formadas. O método mostrou-se específico, linear, preciso, robusto e exato para a quantificação das IA daidzeína, gliciteína e genisteína, e para a quantificação das impurezas hidroximetilfurfural (HMF) e etoximetilfurfural (EMF). Além disso, o método foi concomitantemente validado para a quantificação das IA em diferentes matrizes analíticas e bioanalíticas visando estudos de desenvolvimento de produtos tópicos e estudos de permeação/retenção cutânea. Devido à toxicidade relatada na literatura para o HMF, o presente estudo investigou in vitro o potencial genotóxico e mutagênico do EMF, principal impureza formada após degradação ácida dos açúcares presentes no extrato hidroetanólico de soja. O EMF apresentou potencial genotóxico em linhagem celular do tipo HepG2 nas concentrações próximas ao teor encontrado no extrato. Devido a isso, foi realizada uma investigação de métodos alternativos ao da hidrólise ácida visando à obtenção das IA da soja sem a presença de HMF e EMF, e facilitando, desta forma, os processos de purificação até uma fração enriquecida em IA. Para tanto, foram realizadas otimizações de processos hidrolíticos mais seletivos, tais como hidrólise enzimática com β-glicosidase e fermentação com Saccharomyces cerevisiae. Os processos foram primeiramente avaliados por desenho experimental de Plackett-Burman para determinação dos principais fatores que podem influenciar durante os bioprocessos hidrolíticos. Posteriormente, os métodos foram otimizados por meio de desenho experimental de Box-Behnken. Destaca-se que os processos foram realizados com um extrato equivalente ao extraído de 1,0 g de soja desengordurada. Para o método enzimático, as condições ótimas de processo compreenderam 838 unidades de β-glicosidase, em pH 6.0, durante 4,5 h à 37 ºC. Para o método fermentativo, as condições ótimas de processo hidrolítico compreenderam 1500 mg de fermento comercial contendo Saccharomyces cerevisiae, em pH 7.6, durante 24 h à 33 ºC. Os extratos foram avaliados quanto ao teor de IA, sempre realizando a sua comparação com um extrato não hidrolisado (controle negativo) e com um extrato hidrolisado pela via ácida (controle positivo). O teor de IA após hidrólise enzimática foi estatisticamente semelhante ao controle positivo. No entanto, o processo de fermentação não permitiu completa hidrólise das isoflavonas, sendo necessária a realização de um processo adicional de hidrólise ácida ao final do processo fermentativo. Todos os extratos hidrolisados, ou seja, os obtidos pelas vias ácida, enzimática, fermentativa, fermentativa+ácida, foram avaliados quanto à presença ou ausência de açúcares, compostos furânicos, triterpenos e saponinas. Além disso, todos passaram por processo de partição líquido-líquido com acetato de etila para obtenção de diferentes frações. A fração que apresentou maior pureza e que foi considerada a mais promissora para escalonamento de produção foi obtida após partição do extrato de soja hidrolisado pela via enzimática. Essa fração foi avaliada quanto ao seu potencial in vitro de proliferação de queratinócitos (HaCaT). Após 48 h de tratamento celular, os resultados demonstraram que a fração na concentração de 0,1 μg de IA/mL foi considerada não citotóxica para as células e apresentou promissora atividade proliferativa de queratinócitos. Desta forma, tal fração foi escolhida para ser incorporada em nanoemulsões visando uma futura aplicação tópica durante processos regenerativos de tecidos cutâneos. As formulações foram espessadas, ou não, até hidrogéis de ácido hialurônico. Por fim, foi realizada a avaliação da capacidade de permeação/retenção cutânea das IA a partir das formulações utilizando modelo experimental in vitro com pele de orelha suína. Tanto as nanoemulsões quanto os hidrogéis demonstraram ser promissores sistemas de liberação das IA na pele, aumentando sua retenção em camadas cutâneas consideradas importantes para exercerem seus efeitos benéficos. / Isoflavones are phenolic compounds that promote several benefic effects on the skin. In soybeans, these substances are present in different chemical conformations, mostly as glycoside conjugates. However, the beneficial activities are mainly credited to their aglycone forms. The main goal of this study was the production of an isoflavone aglycone-rich fraction to be incorportated into topical products intended to increase the skin retention of isoflavone aglycones (IA). For that, firstly it was performed a soybean extraction in a hydroethanolic media followed by a classical hydrolysis procedure (acid hydrolysis) to breakdown the conjugated forms until their respective aglycones. To analyze the obtained extract, an ultra-fast liquid chromatography method was developed and validated. The method showed to be specific, linear, precise, robust and accurate for quantification of daidzein, glycitein and genistein, as well as for hydroxymethylfurfural (HMF) and ethoxymethylfurfural (EMF), the main impurities present in the acid hydrolyzed extract. Besides, the method was concomitantly validated for determination of IA in different analytical and bioanalytical matrices during development of topical products and permeation/retention assays. Due to the well-documented toxicity of HMF, this study also investigated in vitro the genotoxic and mutagenic potential of EMF, a sugar degradation product formed after acid hydrolysis of soybean extract. EMF showed to be genotoxic for HepG2 cells at concentrations very close to those present in the extract. So, alternative hydrolysis methods were carried out aiming to obtain the IA from soybeans without the presence of HMF and EMF, and thus facilitating the processes of purification until new IA-rich fractions. For that, procedures with more selectivity properties were accomplished, such as enzymatic hydrolysis with β-glucosidase and fermentation with Saccharomyces cerevisiae. These methods were firstly evaluated by a Plackett-Burman design, to screen the main factors that could be influencing during the hydrolysis of isoflavones present in soybean extract. Further, the methods were optimized by Box-Behnken design. It is important to highpoint that the processes were always carried out with a sample corresponding to the extracted from 1.0 g of defatted soybeans. The highest IA content was achieved under the optimal conditions: enzymatic hydrolysis with 838 units of β-glucosidase, during 4.5 h at pH 6.0 and 37 ºC, or fermentative process with 1500 mg of commercial bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) during 24 h at pH 7.6 and 33 ºC. The extracts were investigated to evaluate the IA content, and the results were always compared with a non-hydrolyzed extract (negative control) and with an acid hydrolyzed extract (positive control). The IA amount after enzymatic hydrolysis was statistically similar than positive control. However, the fermentation did not hydrolyze completely the isoflavones, being necessary an additional acid hydrolysis at end of fermentative process. The extracts obtained by acid, enzymatic, fermentative and fermentative+acid processes were investigated to analyze the presence or absence of sugars, furanic compounds, triterpenes and saponins. Besides, all of them were partitioned with ethyl acetate to obtain IA-rich fractions. The most pure and easily achieved fraction was the one obtained from enzymatic hydrolyzed extract. This fraction was examined to explore its in vitro proliferation ability in keratinocytes cells (HaCaT). After 48 h of cellular treatment, the results showed that the fraction at 0,1 μg de IA/mL was considered non-cytotoxic for cells, and showed a promising proliferative activity. Therefore, this fraction was chosen to be incorporated in nanoemulsions viewing a future topic application during regenerative processes of skin. Moreover, the formulations were thickened, or not, until hyaluronic acid hydrogels. Lastly, it was performed the skin permeation/retention evaluation for IA from formulations using an in vitro experimental model with porcine ear skin. Both nanoemulsions and hydrogels were considered as promisor delivery systems for IA, increasing their retention in skin layers (epidermis and dermis).