The recombinant protein c90 was prepared and polyclonal antibodies against this protein were raised. The dsRNA was made for the experiments with RNA interference. The samples from dissected tissues of dsRNA silenced ticks were tested by RT-PCR and Western blot. Results suggest that protein c90 plays a role in the tick body during the reaction to injury. Finally, another experiment with injection of water, G+ and G- bacteria into the ticks was realized. It was found that the members of the 18,7 kDa protein family can create multimers. The overexpression of silenced genes was observed during RNAi experiments despite of expected inhibition of c90 production. These results together with the bioinformatics analysis could mean that these proteins are important the physiology of tick probably as a reaction to injury. However c90 protein is produced only in the first phase of feeding which could mean that it has some role in the tick-host interaction as well.

Ticks feed on their vertebrate hosts for number of days, providing enough time for development of an effective immune response. To overcome this, tick saliva contains a complex mixture of active substances which mediate host defense mechanisms. Extremely important role at the tick-host interface is played by the protease inhibitors. In this work, we have focused on the protein named Ixocludin 2, a member of the Kunitz type/Bovine trypsin inhibitors of serine proteases, related also to the potassium channel blockers toxins. Three different expression systems (Escherichia coli, Chinese hamster ovary and Pichia pastoris) were tested to prepare an active recombinant Ixocludin 2, out of which, only bacterial system was in part successful.

The Western Fence Lizard (Sceloporus occidentalis) is a major host of juvenile stages of the Western Black-legged Tick (Ixodes pacificus), which is the vector for the Lyme disease causative spirochete bacterium Borrelia burgdorferi in the western United States. Because S. occidentalis is reservoir incompetent and capable of eliminating spirochetes from infected ticks, it has been implicated as a major factor in the ecology of Lyme disease in the West. Although complement proteins in lizard blood have been established as the borreliacidal factor, no studies have examined intraspecific variability in host lizard borreliacidal capacity. In Chapter 1 of this thesis, we introduce the complexity of the Borrelia burgdorferi transmission cycle and it’s implications for transmission risk. In Chapter 2 we tested the hypothesis that host lizard physiological condition impacts their borreliacidal capacity. Blood plasma of lizards in varying physiological conditions was challenged against cultured B. burgdorferi, and the complement-mediated inactivation of spirochetes was quantified. Adult lizards had higher bactericidal activity than first-year juveniles, suggesting that complement-mediated inactivation develops with maturity and/or exposure to spirochete antigens. Also, bactericidal activity was positively associated with lizard tick load and body condition. Adult lizard sex did not significantly affect spirochete mortality. Lizards from an inland site with little exposure to ticks had higher bactericidal activity than lizards from a coastal population that is heavily parasitized by ticks.

La tique Ixodes ricinus est un vecteur de maladies chez l’animal et chez l’Homme d’importance majeure en Europe. Le réchauffement climatique modifiera probablement son profil temporel d’activité. Pour l’évaluation présente et future du risque de piqûre par I. ricinus, des modèles météo-sensibles de prédiction de l’activité sont nécessaires. Dans cette thèse un modèle météo-sensible de régression linéaire généralisé a été ajusté sur des séries temporelles de captures de nymphes, acquises antérieurement à la thèse, pour prédire l’activité saisonnière des nymphes. Depuis ce modèle des profils saisonniers ont été simulés sous scénario de changement climatique. Un modèle de survie météo-sensible a été ajusté à des durées de survie chez des adultes femelles I. ricinus dans un cadre bayésien. Simultanément à la modélisation, nous avons investigué les profils d’activité saisonnière des nymphes I. ricinus sur plusieurs observatoires répartis dans les climats de France métropolitaine par des captures mensuelles en continu d’avril 2014 à juillet 2016. Le comportement d’I. ricinus sous des conditions informatives pour le changement climatique a été investigué. Nos observations et nos simulations confortent l’hypothèse d’une augmentation progressive de l’activité d’I. ricinus sur la saison d’hiver, avec des pics d’activité plus précoces. Une activité modérée a été mise en évidence sous des vagues de chaleur à certains moments du jour, suggérant l’importance de l’échelle infra-journalière en été. Le modèle de survie a reproduit avec succès l’effet très défavorable des conditions sèches sur la survie des femelles. Notre travail de thèse souligne l’importance i) d’acquérir des observations au plus proche des futures conditions saisonnières, ii) de renforcer la sensibilité des modèles de dynamique de populations à la disponibilité en eau dans le milieu des tiques, iii) d’étudier les effets de la météorologie vécue sur la population à l’échelle inter‑annuelle. / The tick species Ixodes ricinus is a vector of major concern for animal and public health in Europe. Climate change will probably modify its activity time patterns. In the present and future bite risk assessment, weather-based models are required to predict tick activity. In this work a weather-based generalized linear regression model was fitted to tick count time series to predict the seasonal activity in I. ricinus nymphs. Using this model we simulated activity time series with climate change weather time series as inputs. A weather-based model was fitted to survival durations in I. ricinus females using a Bayesian estimation method. Simultaneously to modeling, we settled several observatories located in the climate areas encountered in mainland France to investigate the seasonal activity patterns of I. ricinus populations. Monthly tick collection was performed in routine from April 2014 to July 2016. I. ricinus behavior was investigated under conditions which are informative to assess the impact of climate change on activity. Both our observed and simulated results reinforce the hypothesis that activity periods will spread over winter under climate change. In summer season, activity was moderately high at some moments of the day, which underlined that the intra-day scale should be considered when assessing summer activity. The survival model successfully simulated the critical effect of dryness on female survival. In this work we highlighted the need i) to acquire observations under present conditions which are close to the ones projected under climate change, ii) to strengthen the sensitivity of population dynamic models to water availability in the close environment of ticks, and iii) to investigate the effects of the weather conditions undergone by ticks on their population dynamics at the inter-annual scale.

La spécialisation des parasites vis-à-vis de leur(s) hôte(s) et la formation de races d'hôtes sont des processus évolutifs clés dans le maintien et l'émergence de la diversité au sein des populations de parasites. Notre objectif était d'étudier ces processus chez Ixodes uriae, une tique d'oiseaux marins présentant une vaste distribution géographique et une large diversité d'hôtes, afin de mieux comprendre le rôle relatif des contraintes liées à l'hôte et aux facteurs géographiques dans l'évolution et la diversification de ce parasite. Cette question a été abordée à travers différentes approches réunissant des analyses de génétique des populations et de phylogéographie, des analyses morphologiques et une approche expérimentale sur le terrain. Les résultats obtenus montrent que le facteur spatial joue un rôle important dans la diversification d'I. uriae puisque quatre grands groupes géographiques génétiquement isolés ont été identifiés. L'évolution de races d'hôtes est également un processus récurrent de l'évolution d'I. uriae, même si la divergence entre races est plus ou moins marquée d'une région à l'autre. L'évolution des races semble impliquer une préférence d'hôte chez la tique ainsi que des contraintes adaptatives liées à l'hôte, de type mécanique ou physiologique (e.g., bec des oiseaux, digestion du sang, réponse immunitaire). L'ensemble des résultats est cohérent avec la notion d'évolution en mosaïque géographique qui prédit que les interactions entre espèces peuvent évoluer de manière différente dans un contexte spatial hétérogène ; ce qui souligne l'importance des caractéristiques écologiques des hôtes dans la diversification de la tique I. uriae. D'après nos résultats et ceux de différents collègues, la spécialisation d'hôte pourrait s'avérer être un processus commun chez les tiques et donc avoir de profondes implications épidémiologiques et évolutives pour les pathogènes qu'elles transmettent. / Host specialization and host-race formation may be key processes in maintaining and generating diversity within parasite populations. The objective of this thesis was to analyze these processes in the seabird tick Ixodes uriae, a common and widely distributed ectoparasite that exploits a great diversity of seabird host species, to better understand the relative role of host-related constraints and geographic factors in its evolution and diversification. I addressed this question using different approaches, including population genetic and phylogeographic analyses, morphometry and field experimentation. Results show that the spatial factor is a key component in shaping the diversity of I. uriae, as four geographical genetically isolated groups exist within the global distribution of this parasite. The formation of host races is also a general process in the evolution of I. uriae, but has evolved to different degrees in different geographical regions. Host preference in the tick, along with mechanical or physiological host-related constraints (e.g., beak morphology, blood digestion, immune response) are likely involved in the evolution of I. uriae host races. Overall, results fall in line with the geographic mosaic theory of evolution that predicts that the outcome of species interactions can vary across geographic landscapes, highlighting the role played by ecological characteristics of the host in the diversification of I. uriae. Given results to date, host specialization may be a common process in tick systems and thus may have strong epidemiological and evolutionary implications for the pathogens that they transmit.

Le degré de spécialisation d'hôte des parasites peut considérablement modifier la nature des interactions interspécifiques. Lorsque les parasites sont également vecteurs, leur capacité d'adaptation et leur réponse aux changements dans la communauté d'hôtes aura des conséquences importantes sur la dynamique de leurs populations, mais aussi sur les microparasites qu'ils transmettent. Une première étape pour mieux appréhender l'importance de ce phénomène sur l'écologie et l'évolution des systèmes vectoriels est d'étudier la divergence génétique associée à l'hôte. Nous avons utilisé cette approche dans le système hôte-vecteur-pathogène impliquant la tique européenne Ixodes ricinus, ses différents hôtes vertébrés et les bactéries responsables de la maladie de Lyme (Borrelia burgdorferi sl). Ce travail a notamment consisté à tester si les communautés les plus anciennes montraient des divergences associées à l'hôte plus importantes que celles récemment colonisées. Nous avons combiné des échantillonnages de terrain sur un transect européen (comprenant la distribution historique d'I. ricinus et des zones nouvellement colonisées) et, des analyses moléculaires basés sur 14 marqueurs microsatellites (dont 9 nouvellement développés). Comme un obstacle majeur pour aborder la question de la spécificité d'hôte dans le système I. ricinus, ainsi que chez d'autres vecteurs, est de déterminer l'utilisation des hôtes, nous avons également testé expérimentalement les biais rencontrés lors de la détection moléculaire de l'hôte. Nos résultats révèlent un schéma complexe de l'adaptation des tiques à travers l'Europe ; la spécialisation d'hôte peut évoluer, mais l'âge de la communauté ne semble pas être un facteur décisif. Plus généralement, les résultats de cette thèse soulignent que l'écologie des vecteurs en eux-mêmes (et pas seulement les interactions hôtes-pathogènes) doit être considérée avec attention si on veut améliorer notre compréhension de ces systèmes. / The degree of host specialization in parasites can greatly modify the nature of interspecific interactions. When parasites are also vectors, their ability to adapt to new hosts and their response to changes in the host community will have important consequences for both their population dynamics and evolution, but may also cascade down to the microparasites they transmit. A first step to better apprehend the importance of this phenomenon for the evolution and ecology of vector-borne disease systems is to study patterns of host-associated genetic divergence across diverse vector populations. We used this approach in the host-vector-pathogen system involving the European tick Ixodes ricinus, its various vertebrate hosts and the bacteria responsible for Lyme disease Borrelia burgdorferi sl. We predicted that longer established interactions would show stronger patterns of host-associated divergence than more recently established ones. We tested this prediction by combining field samples from a European-wide transect (including both historical and newly colonized zones) and molecular analyses based on 14 microsatellite markers (9 newly developed). As a major obstacle for tackling the question of host associations in the I. ricinus system is determining local host use, we also experimentally tested for biases in molecular host detection. Our results reveal a complex pattern of tick adaptation across the European landscape; host specialization does evolve, but not in a predictable way in relation to the evolutionary age of the interaction. More generally, the results of this thesis highlight that vector ecology (and not just host-pathogen interactions) require careful consideration, if we are to improve our understanding of these systems.

Ixodes ricinus est l’espèce de tique la plus abondante et ayant la plus vaste répartition géographique en Europe. Elle est le vecteur de nombreux agents pathogènes d’importance en santé publique et vétérinaire. Le remplacement des acaricides générant pollution environnementale et apparition croissante de résistances requiert le développement urgent de nouvelles stratégies de lutte efficaces contre les tiques et les agents pathogènes qu’elles transmettent. La découverte de telles stratégies passe nécessairement par une meilleure connaissance des interactions entre les tiques, leurs hôtes et les agents pathogènes transmis. La salive de tique, à l’interface de ces interactions, est un fluide essentiel pour ces arthropodes et possède notamment des propriétés protéolytiques, anticoagulantes, immunomodulatrices, analgésique, et anti-inflammatoires qui permettent à la tique de réaliser ses repas sanguins extrêmement longs. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission des agents pathogènes et pour identifier de possibles candidats vaccinaux contre I. ricinus, une étude transcriptomique comparative entre des glandes salivaires infectées et non infectées par la bactérie Bartonella henselae a été antérieurement réalisée. Le transcrit le plus surexprimé suite à cette infection était IrSPI, un inhibiteur de sérine protéase de la famille des Kunitz. Les analyses fonctionnelles par ARN interférence ont montré l’implication de ce gène dans le gorgement et de l’infection des glandes salivaires par B. henselae. Ainsi, les travaux de thèse présentés ici ont concerné l’analyse structurelle, biochimique et fonctionnelle de IrSPI en tant que molécule impliquée dans les interactions tick-hôte-pathogène. Le premier objectif était de définir la structure et la séquence du gène IrSPI mais, malheureusement, bien que nos résultats aient permit des avancés sur cette question, nous n'avons pu obtenir la totalité de sa séquence. Dans un second temps, la dynamique d’expression d’IrSPI a été évaluée au cours du gorgement et de l’infection des tiques par différents agents pathogènes, montrant que son expression est induite par le repas sanguin, par des agents transmis par la tique mais pas par Escherichia coli, bactérie non transmise. De plus, nos résultats ont montré l’expression de IrSPI dans plusieurs organes de la tique, suggérant son implication dans diverses fonctions au sein de ce vecteur. Parmi elles, la mise en évidence d'une injection, par la salive, de la protéine à l'hôte vertébré nous a permis d'envisager un rôle sur les réponses de l'hôte à la piqûre de tique. Nos résultats n’ont montré aucune implication dans la voie extrinsèque de la coagulation ni dans la fibrinolyse, ni dans l’angiogenèse. En revanche, ils ont démontré que IrSPI inhibe la prolifération des lymphocytes TCD4+ sous stimulation monogénique quand chez des lymphocytes B non stimulés IRSPI, il induit une hausse de la prolifération. De plus IrSPI a montré une action négative significative sur la production de la majorité des cytokines et chimiokines pro-inflammatoires produites par les macrophages et les splénocytes. Ainsi, IrSPI, correspond à un des composants salivaires d’I. ricinus lui permettant de moduler la réponse immune de l’hôte pour lui permettre de prélever son repas sanguin tout en favorisant la transmission des agents pathogènes. Enfin, des résultats préliminaires dans l'identification des interactants de IrSPI à la fois chez la tique et l’hôte vertébré ouvre de nombreuses voies de recherche quant à la compréhension de ses fonctions. / Ixodes ricinus tick species, the most abundant and widespread tick in Europe, is an important vector of pathogens affecting both animal and human health. To replace the use of acaricides that generate environmental contamination and resistances, new environmentally sustainable approaches providing broad protection against ticks and tick-borne pathogens (TBP) are urgently needed. Such development requires improved understanding of the biology of ticks and more particularly of their interactions with vertebrate hosts and TBP. Tick saliva is an essential biofluid for ticks, as its proteolytic, anticoagulant, immunomodulatory, analgesic and anti-inflammatory activities allow ticks to acquire their blood meal under optimal conditions. Moreover, injection of saliva during blood feeding represents the principal route by which TBP are transmitted to the host. To understand the molecular mechanisms involved in TBP transmission, as well as to identify putative vaccine candidates against I. ricinus, salivary glands from bacteria infected and uninfected ticks were previously compared by high throughput transcriptomics. The most up-regulated transcript following infection was IrSPI, which belongs to the Kunitz/BPTI inhibitor family. Functional analyses via RNAi knockdown experiments revealed that IrSPI enhances both blood feeding and bacterial burden in the salivary glands. This present PhD work concerns then the structural, biochemical and functional characterization of IrSPI as a molecule involved in tick-host-pathogen interactions. Our aim was first to define the structure of IrSPI gene but, unfortunately, while our results have led to progress on this issue, we have not been able to get the full sequence. Then, the dynamic of IrSPI expression was evaluated during both tick feeding and colonization of ticks by pathogens, showing that its expression is induced by blood feeding and TBP but not by Escherichia coli that is not transmitted by I. ricinus. In addition, our results shown the expression of IrSPI in several tick organs, suggesting its implication in several functions in tick physiology. Among them, the discovery of the injection of IrSPI, through the saliva, to the vertebrate host allowed us to consider a role in host responses to tick bite. Evaluation of IrSPI effect on host showed no impact on coagulation through extrinsic pathway, as determined by analysis of thrombin generation time and by fibrinolysis, or in angiogenesis. However, it inhibited the proliferation of mitogen-stimulated CD4+ lymphocytes and increased unstimulated-B cell proliferation. In addition, IrSPI also modulated cytokine production from macrophages and splenocytes, repressing significantly most of proinflammatory cytokines and chemokines. Thus, we demonstrated that IrSPI plays a role in modulating the host immune response during blood feeding. Finally, preliminary results in the identification of the protein’s interactants open many research perspectives for understanding how IrSPI acts in tick physiology and counteracts host responses to tick injury and pathogen transmission.

Glycosylation in vertebrates has a main role in many important processes such as cell transport, protein folding, secretion of proteins etc. What function has glycosylation in arthropods, for example in ticks, is rarely studied. This work was focused on analysis of N-glycans in tick tissues, namely in Ixodes ricinus and Dermacentor marginatus. High-mannose glycans as well as complex glycans with or without core-fucosylation were identified in this study.Furthermore several sialylated glycans were present in the studied samples. Sialic acid is found in arthropods rarely and this is the first study which directly proves its presence in ticks using mass spectrometry.

The thesis focuses on the investigation of the role of tick salivary components in the course of Lyme disease in mice. It includes studies on the saliva-facilitated transmission of Borrelia burgdorferi in vivo and the effect of tick cysteine protease inhibitors (cystatins) both on murine immune cells and the transmission of B. burgdorferi spirochetes in mice. The thesis also reveals practical applications of salivary cystatins for the development of anti-tick vaccine and the application of the pharmacological action of a tick salivary cystatin for the therapy of the disease symptoms in a mouse model of experimental asthma.

The hard tick Ixodes ricinus is an important blood-feeding parasite that transmits tick- borne diseases, such as tick-borne encephalitis and Lyme disease. Ticks employ a battery of proteolytic enzymes, including cathepsins, to digest their bloodmeal. These proteins are potential targets for the development of anti-tick vaccines. This work is focused on cathepsin L from I. ricinus (IrCL), namely its isoenzymes IrCL1 and IrCL3. IrCL1 was expressed in Pichia pastoris and chromatographically purified. Its substrate specifity was determined by the cleavage of (a) peptide fluorogenic substrates and (b) protein substrates analyzed by mass spectrometry. The proteolytic activity of IrCL1 was modulated by its interaction with glycosaminoglycans, which affected the pH optimum value. Futhermore, a proteolytically active mutant of IrCL1 with reduced number of N-glycosylation sites was prepared; this form will be used for crystallization experiments. IrCL3 was expressed in Escherichia coli, refolded and activated to its active form. The proteolytic activity of IrCL3 is in many ascpects similar to that of IrCL1, including substrate specifity, acidic pH optimum and activity modulation by glycosaminoglycans. Key words: cysteine proteases, cathepsin L, hard tick I. ricinus, substrate specifity, proteolytic activity...