As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.