<p>Flödescytometrisk cellsortering möjliggör att ur ett större cellmaterial separera en subpopulation celler för vidare analyser. Uppkomst av cytostatikaresistens beror på olika faktorer men där överuttryck av P-gp spelar stor roll. P-gp transporterar aktivt ut cytostatika ur cellen. I studier på AML-celler har man flödescytometriskt påvisat att JC-1 ackumulering speglar P-gp aktivitet. Därmed kan cytostatikaresistenta celler identifieras och sorteras.</p><p>Bröstcancer är den svenska kvinnans vanligaste cancerform där cytostatika ofta ingår i den postoperativa behandlingen. Trots att många patienter svarar på första behandlingen drabbas många ändå av återfall. Problematik med cytostatikaresistens är då vanligt förekommande.</p><p>Syftet med denna studie var att sätta upp en metod för att flödescytometrisk cellsortera avseende olika JC-1 ackumulering och därmed olika cytostatikakänslighet.</p><p>I studien användes färskt brösttumörmaterial och två subcellinjer av leukemicellinjen HL-60. HL-60 S som är känslig för cytostatika och HL-60 R5 som är resistent vid odling med 5 µM doxorubicin.</p><p>Resultaten visade att starkare fluorescensintensitet erhölls vid inkubation och förvaring i JC-1 jämfört med att efter JC-1 inkubation förvara cellerna i D-PBS. Det var möjligt att inkubera ett större antal celler med JC-1 i cellodlingsflaska. Resultaten visar dock att flödescytometrisk sortering kraftigt påverkade viabiliteten hos HL-60 S + R5 där endast två tredjedelar av cellerna var viabla efter sorteringen. Preparering av brösttumörmaterial med Medicon medförde att en betydande andel celler dog och materialet i studien var inte tillräckligt för cellsortering. Att cellsortera kräver kunskap och erfarenhet och det är av vikt att prepareringsmetoden och sorteringsinställningarna optimeras på det material som ska användas i studien.</p>

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

O estresse oxidativo é prejudicial a diversas características espermáticas, como motilidade e integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, podendo levar a redução da fertilidade, inclusive no sêmen refrigerado. Poucos estudos foram realizados utilizando-se a melatonina com o intuito de melhorar as características espermáticas em equinos. O mioinositol e o ácido ferúlico, por sua vez, nunca foram utilizados nessa espécie. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência desses compostos nas características do sêmen equino refrigerado. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Após a coleta, o sêmen foi distribuído entre os quatro tratamentos, sendo eles, melatonina, ácido ferúlico, mioinositol e controle, utilizando-se diluidor á base de leite desnatado, na concentração de 25 milhões de espermatozoides por mL. As amostras foram refrigeradas à 5°C, sob uma curva de refrigeração de 0,09°C/min e avaliadas com 0, 4 e 8 horas de refrigeração, quanto às características de motilidade (CASA), integridade das membranas plasmática, acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial (utilizando-se as sondas fluorescentes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), e quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio (utilizando-se a sonda fluorescente DCFH-DA, por fluorímetria). Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, versão 9.3 (SAS, 2011). As características de motilidade não foram afetadas pelos tratamentos, com exceção da Amplitude Lateral de Cabeça (ALH, µm/s), que foi maior nas amostras tratadas com mioinositol (8,34± 0,21), em relação ao grupo controle (7,87 ± 0,20). Foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento para a variável Velocidade de Trajeto (VAP; P<0,05). Quanto à integridade das membranas, todas as variáveis sofreram efeito dos tratamentos, com exceção da porcentagem de células com membrana plasmática intacta (MPI). A porcentagem de células com membranas íntegras (membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de mitocôndria; PIAIA), foi maior nos grupos tratados com melatonina (78,07 ± 2,02) e com ácido ferúlico (78,78 ± 1,66), em comparação ao grupo controle (73,75 ± 2,01). A porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria (APM), também foi maior nos grupos tratados com melatonina (80,11± 1,85) e com ácido ferúlico (81,01 ± 1,50), em relação ao grupo controle (76,56 ± 1,99). Já a porcentagem de membrana acrossomal intacta (MAI), foi maior no grupo tratado com melatonina (99,69± 0,07), em relação a todos os outros grupos (99,41 ± 0,09; 99,33 ± 0,09; 99,39 ± 0,09; mioinositol, acido ferúlico e controle, respectivamente). A fluorescência emitida, relativa à quantidade de espécies reativas de oxigênio presentes na amostra não foi alterada pelos tratamentos, em nenhum dos tempos. Com isso conclui-se que a adição de melatonina e ácido ferúlico aumenta a porcentagem de células com alto potencial de mitocôndria, sugerindo a adição desses compostos ao diluidor visando maior manutenção da viabilidade por até 8 horas de refrigeração. / Oxidative stress is detrimental to several sperm characteristics such as motility, plasma, acrosomal and mitochondrial membrane integrity, and can lead to reduced fertility, also in cooled semen. Few studies were performed using melatonin intending an improvement in equine sperm characteristics. Para isso, foram utilizadas quatro ejaculados, de quatro animais conhecidamente férteis, com idade entre 4 e 8 anos. Myoinositol and ferulic acid, in turn, were never used in this species. The objective of the present study was to evaluate the influence of these compounds in equine cooled semen characteristics. Four collections from four stallions of known fertility aged between 4 and 8 years old were used. After collection, semen was distributed in one of the four treatments, melatonin, ferulic acid, myoinositol and control. A skim milk based extender was used and semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm per mL. Samples were cooled at 5°C, at a cooling rate of 0.09°C/min and evaluated at 0, 4 and 8 hoours of cooling. CHaracteristics anlyzed were motility (CASA), plasma and acrosomal membrane integrity mytochondrial membrane potential (using florescente probes PI, H342, FITC-PSA e JC-1, using epifluorescence microscopy), and reactive oxygen species production quantification (using DCFH-DA fluorescente probe, by fluorimetry. Data obtained were analyzed using SAS program, 9.3 version (SAS, 2011). Motility characteristics were not affected by treatments, with the exception of average of lateral head displacement (ALH, µm/s), which was greater in myoinositol treated samples (8.34± 0,21), in comparison to the control group (7.87 ± 0.20). An interaction effect was detected between time and treatment for the velocity of the average path (VAP; P<0.05). Regarding membrane integrity, all variables were affected by treatments, with the exception of the percentage of intact plasma membrane cells (IPM). The percentage of cells with intact membranes (intact plasma membrane, intact acrosome, high mytochondrial potential; IPIAH) was greater for the groups treated with melatonin (78.07 ± 2.02) and ferulic acid (78.78 ± 1.66), comparing to the control group (73.75 ± 2.01). The percentage of cells with high mytochondrial potential (HMP) was also greater in melatonina treated group (80.11± 1.85) and ferulic acid (81.01 ± 1.50) comparing to the control group (76.56 ± 1.99). Percentage of cells with intact acrosomal membrane (IAM) was higher in melatonin treated group (99.69± 0.07) than all the other groups (99.41 ± 0.09; 99.33 ± 0.09; 99.39 ± 0.09; myoinositol, ferulic acid and control, respectively). Concerning reactive oxygen species in the sample, emitted fluorescence was not altered by treatments at any moment evaluated. It can be concluded that the addition of melatonin and ferulic acid the percentage of high mitochondrial potential cells, suggesting a beneficial utilization of these coumpounds in the extender for a greater maintenance of viability up to 8 hours of cooling.

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Flödescytometrisk cellsortering möjliggör att ur ett större cellmaterial separera en subpopulation celler för vidare analyser. Uppkomst av cytostatikaresistens beror på olika faktorer men där överuttryck av P-gp spelar stor roll. P-gp transporterar aktivt ut cytostatika ur cellen. I studier på AML-celler har man flödescytometriskt påvisat att JC-1 ackumulering speglar P-gp aktivitet. Därmed kan cytostatikaresistenta celler identifieras och sorteras. Bröstcancer är den svenska kvinnans vanligaste cancerform där cytostatika ofta ingår i den postoperativa behandlingen. Trots att många patienter svarar på första behandlingen drabbas många ändå av återfall. Problematik med cytostatikaresistens är då vanligt förekommande. Syftet med denna studie var att sätta upp en metod för att flödescytometrisk cellsortera avseende olika JC-1 ackumulering och därmed olika cytostatikakänslighet. I studien användes färskt brösttumörmaterial och två subcellinjer av leukemicellinjen HL-60. HL-60 S som är känslig för cytostatika och HL-60 R5 som är resistent vid odling med 5 µM doxorubicin. Resultaten visade att starkare fluorescensintensitet erhölls vid inkubation och förvaring i JC-1 jämfört med att efter JC-1 inkubation förvara cellerna i D-PBS. Det var möjligt att inkubera ett större antal celler med JC-1 i cellodlingsflaska. Resultaten visar dock att flödescytometrisk sortering kraftigt påverkade viabiliteten hos HL-60 S + R5 där endast två tredjedelar av cellerna var viabla efter sorteringen. Preparering av brösttumörmaterial med Medicon medförde att en betydande andel celler dog och materialet i studien var inte tillräckligt för cellsortering. Att cellsortera kräver kunskap och erfarenhet och det är av vikt att prepareringsmetoden och sorteringsinställningarna optimeras på det material som ska användas i studien.

Artificial insemination using cooled, transported semen has become a popular practice in the equine industry. However, equine sperm are assumed to show a decline in their fertilizing ability after 24 to 48 hours of cooled storage. Two measures that are commonly used to estimate the fertility of an ejaculate are sperm motility and sperm membrane integrity (SMI). Recently, it has been suggested that SMI may have a better correlation with fertility of an inseminate than sperm motility. The effect of cooled-storage on sperm quality over an extended time period was evaluated to illustrate changes in sperm characteristics that might be related to an ejaculate’s fertility. Semen was stored at 4°C in INRA 96 extender containing 10% seminal plasma for a period of 10 days. Data were collected daily on sperm motion characteristics, SMI, mitochondrial membrane potential, and DNA quality. To measure daily changes in SMI in stallion sperm, two fluorescent vital-staining protocols used in flow cytometric analysis were compared – a combination of SNARF-1, Yo-Pro-1, and Ethidium Homodimer 1 (SYE) and a combination of lectin from Pisum sativum and propidium iodide (PSA/PI). We hypothesized that the SYE protocol adapted for use with stallion sperm could detect more subtle, and perhaps earlier, damage to the sperm plasma membrane than the PSA/PI protocol. A combination of SYBR 14, propidium iodide, and JC-1 (SYPIJC) was used to measure mitochondrial membrane potential, as well as SMI. A computer-assisted sperm motion analysis (CASA) instrument was used to evaluate sperm motion characteristics; the sperm chromatin structure assay (SCSA) was used to measure the degree of DNA fragmentation. In this study, with the exception of sperm motility, the measures of sperm quality retained values consistent with “viability” after 10 days of cooled-storage. This suggests that the fertility of some stallions may last considerably longer than previously assumed, which could ultimately alter the time-table used for artificial insemination using cooled, transported semen.