Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3187.pdf: 3659896 bytes, checksum: 975ac91a3eb67a4347c326de8f22bf8e (MD5) Previous issue date: 2010-03-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / This master's thesis project aims at studying the dynamic optimization of the operation of a bench scale (up to 5L) automated, agitated and aerated bioreactor, where the semi-continuous cultivation of recombinant Pichia pastoris is run. This yeast was cloned using the PGK1 promoter, which precludes the use of methanol as inducer, expressing constitutively the enzyme penicillin G Acylase (PGA) from Bacillus megaterium. While the group of molecular biology of DEQUFSCar is working on cloning the PGA, d P. pastoris expressing the enzyme - amylase from Bacillus subtilis was cultivated. This clone, provided by prof. Fernando Torres, UnB, uses the same construction and, therefore, its kinetics of growth and production should be very similar to the PGA s. Cultivation of recombinant Pichia pastoris was performed in flasks (skaker) using standard culture medium, aiming at obtaining kinetic data, which are the starting point for the escalation to a benchtop bioreactor. Following that, tests were performed in a 5L bioreactor in batch and fed batch operation modes. With the bioreactor data , kinetic parameters of growth, to be further used in the simulations, were estimated, using a hybrid algorithm (which combines the global method Simulated Annealing, with the local one Levenberg- Marquardt). This algorithm, is implemented in Matlab and available in the software library of Ladabio (Laboratory of Development and Automation of Bioprocesses ). From these data, models of microbial growth and of production were developed, following a classic approach (unstructured, non-segregated). Computer simulations using different feeding strategies and employing these models allowed mapping the dynamics of the system. From this information, optimal control strategies were proposed to define optimal feeding profiles. Cellular concentrations of 5.4 g/L (dry weight) were reached in shaker (20h of cultivation, when glucose is exhausted), expressing 218 U/mL of -amylase, compared to 11.4 g/L (dry weight) that were achieved in cultures in a bioreactor in batch simple (10h of cultivation, when glucose is exhausted), expressing 156 U/mL of -amylase In fed-batch cultures, cell concentrations of up to 45 g/L were achieved, expressing up to 260 U/mL of - amylase, with a productivity of 5.2 U/mL/ h. In fed-batch cultures of P. pastoris expressing PGA, cell concentrations of up to 35 g/L were achieved. Enzyme activity was not detected in the culture broth due to the effect of glycosylation. Immunodetection reaction confirmed the expression of the recombinant enzyme. Four specific growth rate equations were adjusted, with different types of inhibition by one product, detected at significant levels by liquid chromatography highperformance, but not yet identified. This metabolite was added as an inhibitor in kinetic models, using the peak areas, normalized as a pseudoconcentration. The best fit to the experimental data were the Monod kinetic model with non-competitive inhibition. Typical values obtained for the maximum specific growth and glucose/ cell conversion factor in bioreactor were max=0,24 h-1 and YX/S = 0,48. Algorithm for optimal control in open loop was developed and successfully implemented, providing a robust profiles of great power, whose validation is proposed as a continuation of this work. / Este mestrado se propoe a estudar a otimizacao dinamica de biorreator automatizado, tipo tanque agitado e aerado, em escala de bancada (ate 5L), onde se processa o cultivo semi-continuo de Pichia pastoris recombinante. Essa levedura foi clonada pelo grupo do prof. Fernando Torres, da UnB, utilizando o promotor PGK1, que dispensa a utilizacao de metanol como indutor, expressando constitutivamente a enzima -amilase de Bacillus subtilis. Durante a execucao deste mestrado, a enzima penicilina G acilase (PGA) de Bacillus megaterium esta sendo clonada pelo grupo de biologia molecular do DEQ-UFSCar usando a mesma construcao e, portanto, a cinetica de crescimento e producao da PGA heterologa devera ser muito semelhante as da -amilase, utilizada como estudo de caso para otimizacao do bioprocesso. Cultivos de Pichia pastoris recombinante foram realizados em frascos agitados, utilizando meio de cultivo padrao, objetivando o levantamento de dados cineticos, ponto de partida para o escalonamento em biorreator de bancada. Posteriormente, foram realizados ensaios em biorreator de 5L, em batelada e batelada alimentada. Com os dados obtidos nos cultivos em biorreator, e utilizando algoritmo hibrido para estimativa de parametros (que combina o metodo global Simulated Annealing, com o local de Levenberg-Marquardt), implementado em MatLab e disponivel no LaDABio (Laboratorio de Desenvolvimento e Automacao de Bioprocessos), foram ajustados parametros cineticos de crescimento, para serem utilizados nas simulacoes dos cultivos em biorreator. A partir dai, foi desenvolvido modelo de crescimento microbiano e de producao, utilizando um enfoque classico (modelo nao-estruturado, nao-segregado) para descrever o sistema. Com isso, torna-se possivel realizar simulacoes em computador usando diferentes estrategias de alimentacao, para mapear a dinamica do sistema. A seguir, foram desenvolvidos algoritmos de controle otimo em malha aberta para definicao de estrategias de alimentacao. Concentracoes celulares de 5,4 g/L (massa seca) foram alcancadas em cultivos em camara rotatoria (20h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 218 U/mL de -amilase, comparado com 11,4 g/L(massa seca) que foram atingidos em cultivos em biorreator em bateladas simples (10h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 156 U/mL de -amilase. Em cultivos em batelada alimentada concentracoes celulares de ate 45 g/L foram atingidas, expressando ate 260 U/mL de -amilase, com uma produtividade de 5,2 U/mL/h. Em cultivo em batelada alimentada de P. pastoris expressando PGA, concentracoes celulares de ate 35 g/L foram atingidas. Nao foi detectada atividade enzimatica no caldo de cultivo devido ao efeito da glicosilacao. Reacao de imunodeteccao confirmou a expressao da enzima recombinante. Foram ajustadas quatro equacoes de velocidade especifica de crescimento, com diferentes tipos de inibicao por um produto, detectado em niveis importantes por cromatografia liquida de alto desempenho, mas ainda nao identificado. Esse metabolito foi inserido como inibidor nos modelos cineticos, utilizando as areas dos picos, normalizadas, como uma pseudoconcentracao. Os melhores ajustes aos dados experimentais foram com modelo cinetico de Monod com inibicao nao-competitiva. Valores tipicos obtidos para a velocidade especifica maxima de crescimento e de fator de conversao glicose/celula em biorreator foram max = 0,24 h-1 e YX/S = 0,48. Algoritmo de controle otimo em malha aberta foi desenvolvido e implementado com sucesso, prevendo de forma robusta perfis otimos de alimentacao, cuja validacao fica proposta como continuidade deste trabalho.