Tesis para optar al grado de Mag?ster en Ciencias de la Ingenier?a, Menci?n Qu?mica / Memoria para optar al t?tulo de Ingeniero Civil en Biotecnolog?a / La sociedad se enfrenta de forma cada vez m?s fehaciente y cercana a una crisis del modelo energ?tico actual. El uso indiscriminado de combustibles f?siles, y los problemas medioambientales que su uso acarrea han llevado lentamente hacia un cambio de paradigma. Una de las alternativas renovables al uso de estos es la producci?n de bioetanol a partir de desechos lignocelul?sicos. Este proceso, aunque prometedor, presenta problemas en la eficiencia de las etapas de pretratamiento y de hidr?lisis, que no le permiten afianzarse en el mercado energ?tico. En la b?squeda de soluciones, se ha apuntado en los ?ltimos a?os a las prote?nas de hongos capaces de degradar la madera para su consumo. Entre estas, las monooxigenasas l?ticas de polisac?ridos (LPMO) han cobrado gran importancia en el ?ltimo tiempo. Estas son parte importante del proceso de despolimerizaci?n de la celulosa, y su capacidad de aumentar la eficiencia de ?ste las han puesto en el centro de atenci?n. Este trabajo de tesis tiene como objetivo la b?squeda de nuevas LPMOs desde dos hongos: Fusarium oxysporum y Gloeophyllum trabeum. M?s espec?ficamente, se busc? identificar enzimas de inter?s en el secretoma del hongo y secuenciarlas para su posterior an?lisis in silico. Estos objetivos se desarrollaron en una primera instancia a trav?s de la b?squeda de medios de cultivo que indujeran la producci?n de celulasas por parte de los hongos. A partir de la biomasa producida en los cultivos se realiz? una extracci?n de RNA, para luego transcribir el mRNA a cDNA. El cDNA fue utilizado en reacciones de PCR con partidores degenerados. Esto tuvo como fin identificar LPMOs de entre las prote?nas transcritas por el hongo. Los genes identificados fueron amplificados usando partidores espec?ficos, y transformados en E. coli unidos a vectores de clonaci?n. Finalmente los genes fueron secuenciados y esta informaci?n se utiliz? para analizar in silico las propiedades de las LPMOs codificadas por los genes clonados. Se pudo determinar durante el trabajo medios id?neos para la inducci?n de la producci?n de celulasas, y se tuvo la oportunidad de mejorar el proceso de extracci?n de RNA desde hongos. Del proceso de secuenciaci?n se obtuvo las secuencias de un gen perteneciente a G. trabeum y de dos genes pertenecientes a F. oxysporum. Se observ? que las prote?nas que estos codifican poseen los componentes estructurales descritos como indispensables para ser enzimas activas, vale decir las dos histidinas y la tirosina que forman el sitio activo; se estableci? el mapa de restricci?n de los genes, y se realiz? un an?lisis filogen?tico de estos en relaci?n a prote?nas de referencia. Del an?lisis de las secuencias obtenidas se determin? que, seg?n la clasificaci?n vigente, ser?an parte de la subfamilia 3 de las LPMOs. Finalmente, se pudo aproximar mediante herramientas computacionales la estructura tridimensional de estas prote?nas. Se observ? que la estructura predicha sigue los patrones que presentan las LPMOs ya caracterizadas, otro indicador de que se podr?a tratar de enzimas funcionales. En conclusi?n, se puede decir que se cumplieron los objetivos propuestos en este trabajo. Se logr? identificar y secuenciar dos LPMOs expresadas por F. oxysporum y una por G. trabeum. Asimismo, se logr? realizar un an?lisis en profundidad de las secuencias utilizadas. Este permite suponer que se trata efectivamente de prote?nas con el potencial de mejorar el proceso de producci?n de biocombustibles, y que se debiese seguir al siguiente paso l?gico, que corresponder?a al an?lisis de la funcionalidad de la prote?na nativa o expresada en forma heter?loga, y su rol en la degradaci?n de lignocelulosa.

Dans le contexte actuel, il devient nécessaire de rendre les alternatives au pétrole, tel que le bioéthanol 2G, disponibles à grande échelle. Cependant, l’étape d’hydrolyse par les enzymes de Trichoderma reesei reste un verrou à un procédé économiquement stable et rentable. Ces travaux de thèse, s'intègrent dans le cadre du projet Futurol et ont pour objectifs d'identifier et de caractériser de nouvelles enzymes fongiques pour améliorer l'hydrolyse de la biomasse lignocellulosique. A partir des données protéomiques disponibles pour Podospora anserina et Fusarium verticillioides, une douzaine d'enzymes candidates ont été identifiées dans leurs sécrétomes. Ce travail de thèse s'est plus particulièrement focalisé sur les AA9s « Lytic Polysaccharide Monooxygenases » (LPMOs) de P. anserina. Parmi les LPMOs étudiées, PaLPMO9A, PaLPMO9E et PaLPMO9H, qui possèdent un CBM1, sont les plus actives sur la cellulose. La détermination de la régiosélectivité d'action a mis en évidence que PaLPMO9A et PaLPMO9H clivent la cellulose en position C1 et C4 alors que la PaLPMO9E génère uniquement des produits oxydés en C1. La PaLPMO9H est la plus versatile puisqu’elle est active sur les cello-oligosaccharides solubles et sur les polysaccharides hémicellulosiques liés en β-(1,4) (i.e., xyloglucane, glucomannane). La supplémentation du cocktail de T. reesei avec PaLPMO9E ou PaLPMO9H a permis de doubler les rendements d'hydrolyse du miscanthus prétraité. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont permis de démontrer l'importance de ces enzymes oxydatives dans les phénomènes de déconstruction de la lignocellulose chez les champignons filamenteux. / In the current context, it becomes essential to make alternative to oil, such as the 2G bioethanol, available at large scale. However, the hydrolysis step by Trichoderma reesei enzymes remains the major bottleneck for an economically sustainable process. The present work is part of the Futurol project, and aims at identifying and characterizing new fungal enzymes to improve the hydrolysis of lignocellulosic biomass. From the proteomic data available for Podospora anserina and Fusarium verticillioides, a dozen of interesting enzymes were identified in their secretomes. This work focuses, mainly, on the AA9s « Lytic Polysaccharide Monooxygenases » (LPMOs) from P. anserina. Among all the LPMOs studied, PaLPMO9A, PaLPMO9E and PaLPMO9H that harbored a CBM1 were the most active on cellulose. Investigation of their regioselective mode of action revealed that PaLPMO9A and PaLPMO9H oxidatively cleaved at both C1 and C4 positions while PaLPMO9E released only C1-oxidized products. PaLPMO9H that was the most versatile in terms of substrate specificity as it also displayed activity on cello-oligosaccharides and β-(1,4)-linked hemicellulose polysaccharides (e.g., xyloglucan, glucomannan). The hydrolysis yield of the pretreated miscanthus was significantly improved up to 2 fold, when the PaLPMO9E, or PaLPMO9H were supplemented to the T. reesei cocktail. This work demonstrated the importance of these oxidative enzymes for lignocellulose deconstruction by fungi. These biocatalysts open new prospects to improve the enzymatic conversion of plant biomass for 2G bioethanol production.