1 |
Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης και χρήση τους στην ανάπτυξη διαγνωστικών μεθόδων για τη μυασθένειαΤσώνης, Αναστάσιος 07 July 2015 (has links)
Η βαριά μυασθένεια (MG) αποτελεί μια αυτοάνοση νόσο η οποία χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία. Η παθολογία της νόσου προκαλείται από την παρουσία αυτοαντισωμάτων που στοχεύουν πρωτεΐνες της νευρομυϊκής σύναψης (NMJ). Πιο συγκεκριμένα, αντιγονικούς στόχους αποτελούν ο AChR, σε ποσοστό 80-85% των ασθενών, η MuSK σε ποσοστό 5-7% και η LRP4 σε ποσοστό 2-3%. Παρά την εκτεταμένη έρευνα, το ποσοστό των οροαρνητικών μυασθενών (SN-MG), δηλαδή ασθενών που δεν φέρουν αντισώματα για κανένα από τα ήδη γνωστά αντιγόνα, αποτελεί ένα σοβαρό κενό για την πλήρη κατανόηση της νόσου. Το γεγονός αυτό πιθανώς οφείλεται στην ύπαρξη άγνωστων μέχρι σήμερα αντιγόνων ή/και στη χαμηλή ευαισθησία των τεχνικών ανίχνευσης που είναι διαθέσιμες.
Η παρούσα διδακτορική διατριβή έχει ως στόχο την ανάπτυξη ευαίσθητων διαγνωστικών τεχνικών για την ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι των αντιγόνων LRP4 και MuSK συνεισφέροντας στη μείωση των SN-MG. Η ανίχνευση των αντι-LRP4 αντισωμάτων πραγματοποιείται από την ευαίσθητη αλλά μόνο ποιοτική CBA τεχνική. Η ανάπτυξη μιας τεχνικής (RIPA, ELISA) για την ποσοτικοποίηση αυτών των αντισωμάτων είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση της νόσου. Αντιθέτως, σε ότι αφορά στην MuSK-MG, πολύτιμη είναι η ανάπτυξη μιας ευαίσθητης τεχνικής όπου η MuSK θα βρίσκεται στην φυσική της διαμόρφωση (όπως στο CBA), σε αντίθεση με τις μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές (RIPA). Με αυτό τον τρόπο θα είναι δυνατός ο εντοπισμός χαμηλής συγκέντρωσης αντι-MuSK αντισωμάτων ή αντισωμάτων που απαιτούν τη σωστά δομημένη πρωτεΐνη για να ανιχνευθούν.
Η ανάπτυξη μιας ποσοτικής και ευαίσθητης διαγνωστικής μεθόδου ανίχνευσης αντισωμάτων προϋποθέτει την παραγωγή, απομόνωση και καθαρισμό ενός πολύ καλά δομημένου και ακέραιου αντιγόνου. Η ανθρώπινη LRP4 είναι μια μεγάλη διαμεμβρανική πρωτεΐνη (212 kDa) με πολύπλοκες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριμένη πρωτεΐνης καθιστά ιδιαίτερα δύσκολη την παραγωγή της σε ετερόλογα συστήματα έκφρασης. Συνεπώς, επιπλέον από την μοριακή κατασκευή για την έκφραση της διαμεμβρανικής LRP4, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες έκφρασης της εξωκυττάριας περιοχής (ΕΚΠ) της, καθώς και λειτουργικών τμημάτων αυτής. Τα συστήματα έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχθηκαν με γνώμονα τους μεταμεταφραστικούς μηχανισμούς που διαθέτουν, καθώς και με την ικανότητα τους να εκφράσουν μεγάλες ποσότητες των επιθυμητών πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα, για την έκφραση ολόκληρης της LRP4 (1905aa) καθώς και της LRP4-ΕΚΠ (21-1725aa) πρωτεΐνης, χρησιμοποιήθηκαν τα ευκαρυωτικά συστήματα έκφρασης των κυττάρων εντόμων (Sf9) επιμολυσμένα με βακιλοϊό και των θηλαστικών κυττάρων (HEK293), αντίστοιχα. Τα παραπάνω συστήματα έκφρασης είναι ικανά να εκφράσουν σωστά δομημένες πρωτεΐνες, με πλήρως λειτουργική δομή, αλλά συνήθως σε μικρές ποσότητες. Για την έκφραση των μικρότερων αλλά λειτουργικών τμημάτων της LRP4 χρησιμοποιήθηκαν τα συστήματα έκφρασης του ζυμομύκητα P. pastoris και των βακτηρίων E.Coli (BL21). Χαρακτηριστικό των συγκεκριμένων συστημάτων έκφρασης είναι οι μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης που μπορούν να παράξουν. Υπολείπονται όμως στο επίπεδο μεταμεταφραστικών μηχανισμών καθιστώντας δυσκολότερη την έκφραση πολύπλοκων πρωτεϊνικών μορίων. Τα τμήματα της LRP4 όπου τα επίπεδα έκφρασης και καθαρότητας επέτρεπαν την ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων, χρησιμοποιήθηκαν με στόχο την ανίχνευση αντι-LRP4 αντισωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, το LRP4-ΕΚΠ χρησιμοποιήθηκε ως καθηλωμένο αντιγόνο για την ανάπτυξη έμμεσης ELISA, εφαρμογή της οποίας επιβεβαίωσε μόνο το 14% των θετικών για LRP4 αντισώματα MG ασθενών (προηγουμένως ελεγμένοι με CBA). Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μιας ακόμα έμμεσης ELISA με τα τμήματα της LRP4 (785-1093aa, 1093-1439aa και 1004-1306aa) που εκφράστηκαν στο σύστημα έκφρασης των βακτηρίων ως καθηλωμένα αντιγόνα. Με την τεχνική αυτή επιβεβαιώθηκε πάλι περίπου το 10% των LRP4-MG. Ωστόσο, έπειτα από ιωδίωση του τμήματος 21-737aa της LRP4 που εκφράστηκε στον ζυμομύκητα P. pastoris αναπτύχθηκε μια τεχνική RIPA, η εφαρμογή της οποίας ανίχνευσε το 41,2% των θετικών MG για LRP4 αντισώματα. Συνεπώς η RIPA είναι η περισσότερο ευαίσθητη από τις διαγνωστικές τεχνικές που αναπτύχθηκαν. Οι προσπάθειες για την αύξηση της ευαισθησίας των διαγνωστικών εργαλείων που έχουν κατασκευασθεί συνεχίζονται, με στόχο τον ποσοτικό προσδιορισμό των LRP4 αντισωμάτων σε όλους τους LRP4-MG ασθενείς.
Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε έλεγχος τριπλά αρνητικών ορών μυασθενών με την MuSK-CBA τεχνική που αναπτύχθηκε. Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν 633 SN-MG από 13 χώρες. Από τα αποτελέσματα βρέθηκε πως το 13% των SN-MG φέρει αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης MuSK. Η ειδικότητα της μεθόδου επιβεβαιώθηκε έπειτα από έλεγχο ορών υγιών δοτών και ασθενών με άλλες νευρολογικές νόσους εκ των οποίων βρέθηκαν θετικοί σε ποσοστό 1,9% και 5,1% αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι με τη συγκεκριμένη τεχνική ανιχνεύθηκε σημαντικός αριθμός διπλά θετικών ορών (AChR/MuSK και LRP4/MuSK) υποδηλώνοντας πως το συνολικό ποσοστό των πααραπάνω είναι τελικά μεγαλύτερο από αυτό που θεωρείται μέχρι σήμερα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συλλογή και εκτίμηση των κλινικών χαρακτηριστικών των MuSK-CBA θετικών ασθενών. Συνοπτικά, το 27% των SN-MG με οφθαλμική MG (i.e. αποκλειστική εμφάνιση οφθαλμικών συμπτωμάτων) φέρουν αντισώματα έναντι της MuSK. Επιπρόσθετα, το 23% των προσφάτως ανιχνευμένων MuSK-MG εμφανίζει υπερπλασία του θύμου. Τα ποσοστά αυτά είναι πολύ υψηλότερα από εκείνα που έχουν περιγραφεί για τους RIPA θετικούς MuSK-MG ασθενείς.
Η φαρμακευτική αγωγή που λαμβάνουν οι μυασθενείς εξαρτάται από το είδος των αντισωμάτων που φέρουν. Επιπρόσθετα, η πορεία της MG φαίνεται να σχετίζεται σε πολλές περιπτώσεις με την συγκέντρωση των αντισωμάτων αυτών. Συνεπώς η ανάπτυξη διαγνωστικών εργαλείων όπως αυτών που παρουσιάζονται στην παρούσα διατριβή μπορεί να οδηγήσουν σε καλύτερη και γρηγορότερη αντιμετώπιση της νόσου, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των MG ασθενών. / Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease characterized by the presence of antibodies against the muscle components of the neuromuscular junction. The main antigen targets are the AChR, MuSK and LRP4. Antibodies against these three antigens are detected in 80-85%, 5-7% and ~2-3% of the MG patients, respectively. Despite the extensive research that has been done in the field of MG, there is a significant number of patients that do not have any detectable antibodies against the known antigens. These patients are known as seronegative MG patients (SN-MG). SN-MG presents a serious gap in the understanding of the etiology and pathogenic mechanisms of the disease. This is likely due to the presence of unknown antigens and / or the lack of sensitivity of the commercially available diagnostic assays, unable to detect antibodies at low concentrations.
The aim of this thesis was to develop very sensitive diagnostic assays for the detection of anti-LRP4 and anti-MuSK antibodies among the previously SN-MG patients, for the minimization of SN-MG. The detection of anti-LRP4 antibodies is currently undertaken only by the sensitive but qualitative CBA technique. The development of a quantitative technique (RIPA, ELISA) for the quantification of these antibodies is essential for disease monitoring. Regarding the detection of anti-MuSK antibodies, the development of a more sensitive technique, from those used until now (RIPA), is necessary. Α diagnostic assay in which MuSK will be in native form (as in CBA), will give us the opportunity to detect not only low concentration anti-MuSK antibodies but also antibodies which require the native structured protein.
The development of a quantitative and sensitive diagnostic method detecting anti-LRP4 antibodies requires the expression, isolation and purification of an intact antigen (LRP4 in our case). Human LRP4 is a large protein (212 kDa) with many post-transcriptional modifications. Because of the complexity of LRP4, the over-expression of this protein in heterologous expression systems is particularly difficult. For this reason, in addition to the intact LRP4, constructs of the whole extracellular domain (ECD) as well as of functional domains of LRP4-ECD were designed to be expressed in different expression systems. In order to improve the quantity and quality of the expressed recombinant proteins we used various expression systems the selection of which was based on the post-transcription mechanisms available as well as the ability to express large amount of recombinant proteins. More specifically, for the expression of the high complexity intact LRP4 (1905aa) and LRP4-ECD (21-1725aa) proteins, the eukaryotic baculovirus expression system and HEK293 mammalian cells were used, respectively. These expression systems are capable of expressing functional and properly structured proteins but usually in poor yields. On the other hand, for the expression of the smaller and less complex functional domains of LRP4-ECD, the P. pastoris and E. Coli expression systems were used. The latter are able to express large amounts of target proteins but lacking the complicated post-transcription mechanisms. Only few of the designed constructs were expressed at an acceptable level of yield in order to be used for the development of a diagnostic assay.
More specifically, efforts were made to develop an indirect ELISA using the LRP4-ECD as an immobilized antigen. Using this technique was achieved the identification of only 14% of the anti-LRP4 positive MG sera (identified by CBA). In addition, the expressed in E. Coli domains of LRP4 (785-1093aa, 1093-1439aa, 1004-1306aa) used for the development of another indirect ELISA, identified the ~10% of LRP4-MG. However, using the expressed in P. pastoris LRP4 domain (21-737aa), a RIPA technique was developed identifying the 41.2% of LRP4-CBA positive MG sera. From the developed assays, RIPA seems to be the most sensitive one. Nevertheless efforts focused on the sensitivity improvements of the developed quantitative assays continue, aiming the quantification of the anti-LRP4 antibodies in LRP4-MG sera.
In the second part of this thesis we applied a CBA for the detection of MuSK antibodies undetectable by RIPA. We tested 633 triple-SN-MG patients' sera from 13 countries, and detected 13% of these sera as MuSK-positive. MuSK antibodies were found, at significantly lower frequencies, in 1.9% of healthy controls and 5.1% of patients with other neuroimmune diseases. Interestingly, we also detected a significant number of double positives (AChR/MuSK-MG, LRP4/MuSK-MG), suggesting their overall rate is more frequent than previously described. Moreover, the clinical data of the newly diagnosed MuSK-MG patients were collected and evaluated. Importantly, we found that 27% of SN-MG patients with ocular MG (i.e. MG with only ocular symptoms present) were MuSK antibody positive, whereas 23% of the newly identified MuSK-MG patients had thymic hyperplasia suggesting thymic abnormalities; these percentages are much higher than those described earlier for classical MuSK-MG.
The treatment of MG depends on the type of the circulating autoantibodies. Moreover, the course of the disease is associated with the antibody titer. Therefore, the development of diagnostic tools like these mentioned above can lead to a faster and better disease treatment, improving the quality of MG patients’ life.
|
Page generated in 0.0259 seconds