Advances in our understanding of the molecular events leading to cancer have facilitated the development of next-generation targeted therapies. Among the most promising new approaches is immuno-oncology, where therapeutic agents engage the immune system to fight cancer. One exciting strategy therein is the adoptive transfer of ex vivo cultivated tumor-specific T lymphocytes into a cancer patient. Tumor-specific T cells can be produced by engineering a patient’s own T cells with synthetic receptors (e.g. chimeric antigen receptors (CARs)) designed to redirect T cell cytotoxicity against a tumor target. CAR-engineered T cells (CAR-T cells) were expected to be a non-toxic cellular therapy which would seek out and specifically eliminate disseminated tumors. The clinical experience supports the promise of CAR-T cell therapy (striking efficacy has been observed in the treatment of hematological malignancies), while highlighting areas for improvement; CAR-T cell use has been associated with a host of toxicities and robust clinical efficacy has yet to be replicated in solid tumors. This thesis uses pre-clinical models to describe previously unappreciated aspects of CAR-T cell-associated toxicity and novel synthetic receptor strategies, including: i. The capacity of NKG2D-based CAR-T cells to mediate toxicity. ii. The utility of designed ankyrin repeat proteins as CAR antigen-binding domains. iii. The discovery that variables intrinsic to human CAR-T cell products contribute to toxicity. iv. A novel synthetic receptor capable of redirecting T cell specificity against a tumor target – the T cell antigen coupler (TAC). Unlike equivalent CAR-T cells, TAC-T cells are capable of mediating efficacy against a solid tumor in the absence of toxicity. We anticipate that these results will contribute towards the development of next-generation synthetic receptor-engineered T cell products that can deliver upon the promise of safe, systemic cancer therapeutics. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / The human immune system has the unique capacity to “seek and destroy” tumor cells throughout the body. A novel class of drugs, immuno-oncology agents, harness this ability to fight cancer. Within this class is a new cellular drug where genetic engineering is used to create killer immune cells (called T cells) capable of recognizing and eliminating tumors. Two of these cellular drugs have recently received FDA approval, supporting the feasibility of this approach. However, further research is needed to improve the safety of engineered-T cells and increase the number of patients whom can benefit from their use. This thesis uses laboratory investigations to better understand the side-effects associated with anti-cancer engineered-T cells and evaluate new engineering strategies. We anticipate that these results will contribute towards the development of next-generation engineered-T cell drugs which retain the ability to function systemically against cancer but offer an enhanced safety profile.

Antibody responses can be up- or down-regulated by passive administration of specific antibody together with antigen. Depending on the structure of the antigen and the antibody isotype, responses can be completely suppressed or enhanced up to a 1000-fold of what is seen in animals immunized with antigen alone. IgG suppresses primary antibody responses against erythrocytes. Suppression works well in mice lacking Fc-receptors for IgG, C1q, C3, or complement receptor 1 and 2 (CR1/2). Here, we demonstrate that IgG anti-NP given to mice together with NP-conjugated sheep erythrocytes, suppresses the generation of NP-specific extra-follicular antibody-secreting cells, NP-specific germinal center B cells, induction of memory and long-lived plasma cells. IgG increases antigen clearance but this does not explain the suppressed antibody response. It is demonstrated that IgG-mediated suppression of IgG responses is epitope specific, suggesting that epitope masking is the dominant explanation for IgG-mediated suppression of antibody responses. Both IgE and IgG3 can enhance antibody responses against soluble antigens. IgE-antigen complexes bind to recirculating B cells expressing CD23, an Fc-receptor for IgE.  Thirty minutes after intravenous administration, IgE-antigen is found in splenic follicles. Subsequently, germinal center responses, antigen-specific T cell proliferation, and antibody responses are enhanced. We show that also antigen conjugated to anti-CD23 can bind to CD23+ B cells and be transported to splenic follicles. CD11+ spleen cells, rather than CD23+ B cells, present IgE-antigen complexes to T cells. Here, it is demonstrated that CD8α− conventional dendritic cells is the CD11c+ cell population presenting IgE-antigen to T cells. IgG3-mediated enhancement is dependent on CR1/2. We find that IgG3-antigen complexes, administered intravenously to mice, bind to marginal zone B cells via CR1/2. These cells then transport IgG3-antigen into splenic follicles and deposit antigen onto follicular dendritic cells. Mice treated with FTY720, a drug which dislocates marginal zone B cells from the marginal zone, impairs this transport. Studies in bone marrow chimeric mice show that CR1/2 on both B cells and follicular dendritic cells are crucial for IgG3-mediated enhancement. In summary, these observations suggest that antibodies can feedback regulate antibody responses by modulating the access of antigen to the immune system.

Author: Bc. Dagmar Bakerová Supervisor: MUDr. Vít Řeháček Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Title of diploma thesis: RhD antigen screening by molecular genetic methods This thesis deals with the genotyping of weak and partial antigens using molecular genetic methods. The main aim is to evaluate the rate of the representation of individual types of variant and weak RhD antigens in first-time blood donors, patients and pregnant women. Testing took place at the Transfusion Department of University Hospital Hradec Králové between October 2015 and February 2019. The PCR-SSP method was used for RHD genotyping using commercially supplied BAGene SSP kits from BAGene Health Care. The study includes 32 samples from first-time blood donors in the reference period to determine the specific type of RhD antigen, and 188 samples from patients and pregnant women, for whom serological methods could not be used to unequivocally identify the RhD antigen. For all pregnant women, moreover, the genotyping result was a factor in determining whether to administer anti-D immunoglobulin. This RHD genotyping for all serologically ambiguous samples has made it possible to determine a specific type of partial or weak RhD antigen. In the donor group, the weak RhD antigen was detected in 1.12 % of cases...

Les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I (CMH I) contrôlent la plasticité synaptique dans le système nerveux central (SNC) et plusieurs travaux expérimentaux suggèrent des interactions antigène-dépendantes entre des neurones infectés par des virus et les lymphocytes T CD8. Cependant, le rôle de la présentation des antigènes par le CMH I des neurones sur la physiopathologie de l'infection par Toxoplasma gondii (T. gondii) n'a pas encore été clarifié. Après la dissémination aigue sous forme de tachyzoites, T. gondii se convertit en bradyzoites, forme persistante dans les neurones du SNC. Chez les individus immunocompétents, la toxoplasmose latente est associée à des variations des fonctions cognitives ainsi qu'à des pathologies neuropsychiatriques. Les sujets dont le système immunitaire est dysfonctionnel peuvent développer une encéphalite létale causée par T. gondii, qui est caractérisée par une réplication du parasite, une infiltration massive et des agrégats leucocytaires et l'activation des cellules gliales. Les lymphocytes T (LT) CD8 et le CMH I sont des facteurs-clés contrôlant la résistance à l'encéphalite. Utiliser les LT CD8 pour éliminer les kystes chez des sujets à risque est une piste thérapeutique intéressante en raison de l'absence d'approches pharmacologiques ciblant les bradyzoites. A ce jour, les mécanismes et la pertinence fonctionnelle de la présentation des antigènes dérivés de T. gondii par les neurones restent à déterminer, ainsi que la contribution des différents stades parasitaires au contrôle de l'infection. L'utilisation de nouveaux parasites exprimant un antigène immunodominant uniquement au stade tachyzoite a permis de montrer que la reconnaissance par les LT CD8 d'antigènes issus des tachyzoites est suffisante pour une protection efficace contre l'encéphalite.[...] / In the Central Nervous System (CNS), Major Histocompatibility Complex class I (MHC I) molecules regulate synaptic plasticity and evidence suggests antigen-specific interactions between virus-infected neurons and CD8 T cells. Yet, little is known about the impact of neuronal MHC I presentation on the pathophysiology of infection by the neurotropic Toxoplasma gondii (T. gondii) parasite. Following acute dissemination as tachyzoites, T. gondii converts into bradyzoites that persist inside cysts within neurons of the CNS. In immunocompetent hosts, latent toxoplasmosis is associated with cognitive changes and neuropsychiatric disorders. Hosts with sub-optimal immune responses may develop a lethal T. gondii Encephalitis (TE), characterized by parasite replication, granuloma-like structures with massive immune cell influx and glial cell activation. CD8 T cells and MHC I are key determinants of TE resistance. Harnessing CD8 T cells in at-risk individuals may turn helpful in the future as we are currently lacking an effective pharmacological approach to eradicate bradyzoites. Yet the mechanisms and functional relevance of neuronal MHC I presentation of T. gondii remain unexplored, as well as which stage of the parasite contributes to efficient control of the infection. Using new T. gondii parasites with restricted expression of the immunodominant antigen at the tachyzoite stage, this work showed that CD8 T cell recognition of tachyzoite antigens at early stages of brain invasion is enough to protect from TE. Interestingly, by comparing situations of toxoplasmosis with varying TE severity and by pioneering antigen presentation assays with T. gondii-infected primary neurons, we revealed that TE susceptibility may be underlied by sub-optimal MHC I presentation of tachyzoites antigens by neurons. At last, we describe a mouse model that allows conditional deletion of a MHC I allele that is essential for TE resistance (H-2Ld). [...]

Exosomes are extracellular vesicles of endosomal origin. It was thought, that exosomes are used by cells only as carriers for cellular waste, but it was found out, that exosomes serve in the cellular communication and have a role in viral infections. Exosomes are exploited by viruses for example for the transport of viral protein or viral RNA/DNA. One of the viruses, where the mechanism of exploitation is unknown (if any exists) is murine polyomavirus. Murine polyomavirus belongs to the family Polyomaviridae, to which other human viruses belong for example, JC virus or virus of Merkel cell carcinoma. Murine polyomavirus codes for small, large and middle T antigen and three capsid proteins. Middle T antigen is known to bind to cellular membranes. Exosomes are membrane derived structures, so we investigated a possible transfer of middle T antigen. To this goal the successful isolation of exosomes and their characterization was necessary. Exosomes were isolated by ultracentrifugation and further purified by the density gradient OptiPrep. Exosomes were characterized by electron microscopy, NanoSight and by protein exosomal markers. These markers are for example Alix and flotillin-1. The cells were transfected in order to produce middle T antigen. It was shown, that exosomes isolated from these cells...

Das La-Protein wurde als Autoantigen bei Autoimmunpatienten, die an SLE oder Sjögren-Syndrom erkrankt sind, entdeckt. Es kommt in phosphorylierter Form im Zellkern aller Eukaryonten vor und nimmt Aufgaben bei der Faltung, Prozessierung und nukleären Retention von RNA-Polymerase III-Transkripten wahr. Unter normalen zellulären Bedingungen ist das La-Protein außerdem in der Lage, zwischen Zellkern und Zytoplasma zu pendeln. Bei Zellstress, der nach UV-Exposition oder während einer viralen Infektion entsteht, wird das Protein verstärkt im Zytoplasma beobachtet, wo es an der Cap-unabhängigen Translation zellulärer und ggf. viraler Proteine beteiligt ist. Wird in der Zelle daraufhin Apoptose induziert, so ist das La-Protein auf der Zellmembran bzw. in apoptotischen Körperchen nachweisbar. Ein wesentlicher Bestandteil dieser Arbeit war die Untersuchung verschiedener monoklonaler anti-La-Antikörper. Einige wenige konnten durch wiederholte Immunisierung von Mäusen mit rhLa-Protein generiert werden. Im Gegensatz dazu resultierte die einmalige Übertragung von gegen das hLa-Protein aktivierten CD4+ T-Zellen auf eine hLaTg-Maus in der Gewinnung mehrerer La-spezifischer Antikörper. Die Sequenzanalyse der Gene, die für die variablen Antikörperdomänen codieren, bestätigte, dass es sich um individuell rekombinierte und hypermutierte Immunglobuline handelt. Die Antikörper zeichneten sich außerdem durch unterschiedliche Eigenschaften bei der Bindung von humanem und murinem La-Protein in der Immunfluoreszenz, im Immunoblot oder während der Immunpräzipitation aus. Für die IgG-Antikörper konnten die Epitopbereiche innerhalb des La-Proteins eingegrenzt werden. Auffällig waren die kurzen linearen Peptidepitope, die von den auf konventionelle Art erzeugten Antikörpern gebunden wurden. Hingegen erkannten alle Antikörper, die aus dem adoptiven T-Zell-Transfer hervorgegangen waren, Konformationsepitope. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass einige mAks aber auch anti-La-Patientenseren die reduzierte von der oxidierten Form des La-Proteins unterscheiden können. Unerwartet ist die Erkenntnis, dass sich offensichtlich zahlreiche B-Zellen mit anti-La-Spezifität von wenigen variablen Ketten ableiten und dass diese bei einer herkömmlichen Immunisierung entweder nicht aktiviert werden (und deshalb nicht in der Milz zu finden sind) oder sogar eliminiert werden. Der Import des La-Proteins in den Zellkern wird durch die klassischen Transportmoleküle Karyopherin-α und Karyopherin–β vermittelt. Für den Shuttlingprozess muss das Protein auch wieder aus dem Kern exportiert werden. Da es kontroverse Daten bezüglich eines Crm1-abhängigen Kernexports gab, wurde das Shuttlingverhalten von GFP-La-Fusionsproteinen in dieser Arbeit genauer analysiert. Mit Hilfe von Heterokaryonexperimenten konnte bestätigt werden, dass sowohl das hLa- als auch das mLa-Protein zwischen humanen und murinen Zellkernen pendeln kann und dass der Export unabhängig von Crm1 stattfindet. Aufgrund der kurzen Verweildauer im Zytoplasma schienen die Proteine quantitativ im Zellkern vorzuliegen, doch ein Teil konnte stets in den im Heterokaryon enthaltenen Nachbarzellkernen detektiert werden. Die Verwendung von N-terminal deletierten La-Fragmenten, die alle über das C-terminale NLS verfügten, gab Aufschluss über die Regulation des Shuttlings. Es zeigte sich, dass die Menge des exportierten Proteins von einem nukleären Retentionspartner festgelegt wird, der das La-Protein bindet und dadurch im Zellkern festhält. Wird diese Assoziation aufgehoben, gelangt das La-Protein in das Zytoplasma. Dort ist es allerdings nicht detektierbar, da das NLS einen umgehenden Import zurück in den Zellkern hervorruft. Zusätzlich wurde die Auswirkung von zellulärem Stress (z. B. durch ROS) auf die intrazelluläre Lokalisation des Proteins untersucht. Unter oxidativen zellulären Bedingungen wird einerseits die Wechselwirkung mit dem nukleären Retentionspartner aufgehoben und andererseits findet kein Kernimport über Karyopherin-α mehr statt. Aus diesem Grund reichert sich das La-Protein nun verstärkt im Zytoplasma an. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und daraufhin auf die Membran von Nachbarzellen binden kann. Die Bindungs-eigenschaften wurden mit rhLa-Protein genauer untersucht. Das La-Protein war auf Endothel- und Epithelzellen nachweisbar und die Bindung fand sowohl bei Inkubation auf Eis als auch bei 37 °C statt. Da das La-Protein auch über DNA-Bindungseigenschaften verfügt, war es in der Lage, DNA auf der Zelloberfläche zu immobilisieren. Innerhalb von PBMCs wurde es selektiv auf Antigen-präsentierenden Zellen nachgewiesen. Diese Eigenschaften lassen eine Beteiligung des Proteins bei der Induktion von anti-dsDNA-Antikörpern in Autoimmunpatienten vermuten. Es ist bekannt, dass die Bedingungen (Virusinfektion, UV-Exposition), die zur Translokation des La-Proteins auf die Zelloberfläche führen, bei SLE-Patienten Krankheitsschübe auslösen können. Bisher wurden anti-La-Autoantikörper aber eher nicht als pathophysiologisch erachtet, da sie bei der Bindung an bereits apoptotische Zellen keine weiteren Schäden verursachen können. Jedoch wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das La-Protein apoptotischer Zellen auf der Oberfläche von lebenden Zellen in der Umgebung nachgewiesen werden kann. Daran könnten anti-La-Autoantikörper binden und eine Komplement- oder NK-Zell-vermittelte Zerstörung der Nachbarzellen hervorrufen. Dadurch entstehen zusätzliche Gewebeschäden. Im Chromfreisetzungstest waren NK-Zellen tatsächlich in der Lage, La-dekorierte Zielzellen Antikörper-abhängig zu lysieren, sofern zusätzliche in vitro Stimuli präsent waren, die z. B. eine virale Infektion simulierten. Die Immuntherapie von Tumoren ist auf bestimmte Zielstrukturen auf den Tumorzellen angewiesen, über welche die Wirkstoffe spezifisch zu den maligne transformierten Zellen gebracht werden. Die Therapeutika, die sich oft von mAks gegen diese Zielstrukturen ableiten, müssen für verschiedene Tumorarten individuell entwickelt werden. Da das La-Protein von apoptotischen Zellen freigesetzt wird und auf die Membran benachbarter (bestrahlungsresistenter) Zellen binden kann, ist es in Kombination mit einer vorangegangenen Bestrahlung als universelle Zielstruktur für die Immuntherapie nutzbar. Aus diesem Grund wurde unter Verwendung eines ausführlich in dieser Arbeit charakterisierten anti-La-Antikörpers ein rekombinantes bispezifisches Antikörperderivat entwickelt. Es ist in der Lage, das La-Protein auf der Oberfläche von Tumorzellen zu binden und auf diesen zytotoxische T-Lymphozyten zu immobilisieren. Durch die Quervernetzung werden die T-Lymphozyten aktiviert und induzieren in den Zielzellen Apoptose. Das neue Antikörperderivat verspricht eine vielseitige Anwendung in Kombination mit Strahlentherapie oder auch mit rekombinanten Antikörpermolekülen, die gegen spezifische Zielstrukturen auf den Tumorzellen gerichtet sind.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 100-117).

Dendritische Polymere werden im zunehmenden Maße als nicht-virale Vektoren für virus- oder tumor-assoziierte Antigen-Peptide zur Entwicklung neuer immuntherapeutischer Strategien eingesetzt. Diese beruhen auf der Verwendung von dendritischen Zellen (DCs), welche Schlüsselzellen bei der Induktion und Aufrechterhaltung einer T-Zell-basierten Immunantwort darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Nitrilotriessigsäure-funktionalisierte dendritische Glycopolymere (NTA-DG) für den Transport von Antigen-Peptiden in DCs etabliert. Die Ni(II)-NTA-DGs waren durch definierte Komplexierungs- und Freisetzungseigenschaften charakterisiert. So wurde das Antigen-Peptid bei einem pH-Wert unter 6 vom polymeren Träger freigesetzt. Die gebildeten Polyplexe, zwischen Ni(II)-NTA-DG und dem Antigen-Peptid, bewirkten eine Erhöhung der Antigen-Peptid-Aufnahme in immaturen DCs (iDCs). Dieses war nach der Endozytose im frühen endosomalen und lysosomalen Kompartiment von iDCs lokalisiert. Somit kann das Antigen-Peptid am MHC Klasse II-Molekül im lysosomalen Kompartiment ohne sterische Hinderungen durch die Polymeroberfläche binden. Die Polyplexe bewirkten eine Aktivierung der iDCs durch Aufregulation der kostimulatorischen Moleküle CD86 und CD80 sowie der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-8. Weiterhin wurde die Migrationsfähigkeit und das pro-inflammatorische Potential der Antigen-Peptid enthaltenen maturen DCs (mDCs) aufrechterhalten. Somit stellen Ni(II)-NTA-DGs ein vielversprechendes polymeres Trägersystem für Antigen-Peptide dar.

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In this PhD thesis the potential of T-cells as therapy for disease are explored. The applications of genetically modified T-cells for treatment of cancer and autoimmune disease; the functionality and optimal activation of T-cells are discussed. Successful treatment of cancer with T-cell receptor (TCR)-modified T-cells was first reported in 2006, and is based on recognition of a specific peptide by the TCR in the context of the MHC molecule. As antigen presentation in tumors is often defective and to avoid MHC-restriction, chimeric antigen receptors (CAR) molecules containing an antibody part for recognition of cell surface antigens and TCR and co-receptor signaling domains have been developed. Activated T-cells mount an efficient immune response resulting in the killing of the cancer cell and initiating T-cell proliferation. The rationale for using genetically modified T-cells instead of isolating tumor infiltrating lymphocytes from the tumor and expanding them (TIL therapy) is that it is often very difficult to obtain viable lymphocytes that are able to expand enough in order to use them for therapy. This thesis explores the possibility of using prostate-specific antigens to target T-cells towards prostate cancer. The prostate has many unique tissue antigens but most patients with metastatic prostate cancer have undergone prostatectomy and consequently have “prostate antigen” expression only in cancer cells. We targeted the prostate antigens TARP and PSCA with a HLA-A2 restricted TCR and a CAR respectively. In both cases the tumor-specific T-cells were able to generate potent proliferative and cytotoxic responses in vitro. The PSCA CAR-modified T-cells delayed subcutaneous tumor growth in vivo. It is evident from our in vivo experiments that the PSCA CAR T-cells were unable to completely cure the mice. Therefore, we aimed to improve the quality of the transferred T-cells and their resistance to the immunosuppressive tumor microenvironment. Stimulation with allogeneic lymphocyte-licensed DCs improved the resistance to oxidative stress and antitumor activity of the T-cells. We further investigated the potential of genetically modified regulatory T-cells (Tregs) to suppress effector cells in an antigen-specific manner. Using a strong TCR we hypothesize that the phenotype of the TCR-transduced Tregs may be affected by antigen activation of those cells. We found that the engineered Tregs produced cytokines consistent with Th1, Th2 and Treg phenotypes.