SUMMARY<p><p>Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease caused by progressive destruction of insulin-producing pancreatic beta-cells. Both viral infections and the cytokines interleukin-1beta (IL-1beta) and interferon-gamma (IFN-gamma) have been suggested as potential mediators of beta-cell death in early T1DM. Nitric oxide (NO) is a highly diffusible, short-lived free radical gas, which plays a significant role in several physiological processes in a diversity of tissues and organisms. Prolonged exposure of rodent or human pancreatic beta-cells to combinations of cytokines induces the expression of the inducible form of nitric oxide synthase (iNOS) and Fas, NO production, and cell death. It also induces the expression of potential "defense" genes, such as manganese superoxide dismutase (MnSOD) and heat shock protein (hsp) 70. Recent studies have shown that NO, in addition to having cytotoxic actions, may also regulate gene transcription. It remains unclear whether NO mediates cytokine-induced gene expression and subsequent beta-cell death. Previous studies using NO synthase blockers yielded conflicting results, which may be due to non-specific effects of these agents. <p>In the first part of our work, we examined the role of NO in beta-cell dysfunction and death by using an iNOS knockout mice (iNOS-/-, background C57BL/6x129SvEv). We evaluated the effects of cytokines on gene expression, as determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and viability, as determined by nuclear dyes, of pancreatic islet cells or fluorescence-activated cell sorter (FACS)-purified beta-cells isolated from iNOS knockout mice or their respective controls (C57BL/6x129SvEv). The combination of cytokines used was interleukin-1beta (50 U/ml) + gamma-interferon (1000 U/ml) + tumor necrosis factor-alpha (1000 U/ml). The lack of cytokine-induced iNOS activity in the iNOS-/- islet cells was confirmed by RT-PCR and nitrite determination. Cytokines induced a > 3-fold increase in Fas and MnSOD mRNA expression in wild-type (wt) and iNOS-/- islets. On the other hand, hsp 70 was induced in wt but not in iNOS-/- islets. Prolonged (6-9 days) exposure of wt islets to cytokines lead to an 80-90% decrease in islet cell viability, whereas viability decreased by only 10-30% in iNOS-/- islet cells. To determine the mode of cytokine-induced cell death, FACS-purified beta-cells were exposed to the same cytokines. After 9 days, the apoptosis index was similarly increased in wt (39 +/- 3%) and iNOS-/- (33 +/- 4 %) beta-cells. On the other hand, cytokines increased necrosis in wt (20 +/- 4 %) but not in iNOS-/- (7 +/- 3 %) beta-cells. From these data, we conclude that: 1) NO is required for cytokine-induced hsp 70 mRNA expression, but not for Fas and MnSOD expression; 2) cytokines induce both apoptosis and necrosis in mouse beta-cells; 3) cytokine-induced apoptosis is mostly NO-independent, whereas necrosis requires NO formation.<p>In the second part of our work, we examined the role of the viral product double-stranded RNA (dsRNA) in beta-cell dysfunction and death. DsRNA is produced by many viruses during their replicative cycle. We investigated whether dsRNA (here utilized as synthetic poly IC (PIC)) modifies the effects of IL-1beta and IFN-gamma on gene expression and viability of rat pancreatic beta-cells and the role of NO in this process. FACS-purified rat beta-cells were exposed for 6-16 h (study of gene expression by RT-PCR) or 6-9 days (study of viability by nuclear dyes) to PIC and/or IL-1beta or IFN-gamma. PIC increased the expression of Fas and Mn superoxide dismutase mRNAs by 5-10-fold. IL-1beta and a combination of PIC + IFN-gamma& / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La prévalence de l’obésité et du diabète de type 1 (DT1) s’accroit dans le monde à une vitesse alarmante. L’augmentation du poids corporel, de la quantité d’acides gras libres (AGL) circulant et de la résistance à l’insuline peut induire un stress du réticulum endoplasmique (RE) dans les cellules beta du pancréas, ce qui pourrait favoriser l’inflammation. Afin de tester cette hypothèse, nous avons exposé des cellules beta à un léger stress chronique du RE induit par de l’acide ciclopiazonique (ACP) ou l’AGL palmitate et les avons ensuite traitées avec une faible dose d’interleukine 1β (IL-1β) ou de facteur de nécrose tumorale (TNF-α). L’addition d’IL- 1β, mais pas de TNF-α, a conduit à l’augmentation de la production de marqueurs pro-inflammatoires et de chimiokines. Cette différence de résultat en fonction de l’exposition à l’IL-1β ou au TNF-α peut-être au moins partiellement expliquée par un usage différentiel du complexe de la kinase IκB (IKK) et de la voie du facteur nucléaire κ-B (NF-κB), menant à terme à une activation plus élevée par l’IL-1β en comparaison à TNF-α. L’analyse des branches de la réponse de la protéine dépliée impliquées a révélé que la voie de l’Inositol-requiring enzyme 1 (IRE1) / X-box binding protein 1 spliced (XBP1s) est le médiateur clé dans le couplage avec la réponse inflammatoire déclenchée par l’IL-1β. En effet, le knockdown d’IRE1 ou de XBP1 a permis d’éviter l’exacerbation de l’activité du promoteur NF-κB et l’expression des gènes cibles de NF-κB. Les mécanismes impliqués dans la régulation XBP1-dépendante de la réponse pro-inflammatoire sont partiellement dépendant de la modulation de la Forkhead box O1 (FoxO1). Le stress du RE et l’IL-1β participent aussi à un autre évènement crucial dans le développement du DT1, à savoir la mort progressive des cellules beta, qui est également exacerbée par la combinaison ACP + IL-1β. Contrairement à l’inflammation, la voie IRE1/XBP1 n’est pas impliquée dans l’apoptose cellulaire induite par la combinaison d’ACP et d’IL-1β. Dans ce contexte, nous suggérons que le devenir de la cellule est décidé par la balance entre les protéines Bcl-2 anti-apoptotiques et pro-apoptotiques. Ainsi, nous avons montré que le gène A1 associé à Bcl-2 (A1) est négativement régulé par le stress du RE tandis que l’IL-1β active la protéine BH3-only Bim, aboutissant à une apoptose accrue des cellules beta. En conclusion, nos données suggèrent que le stress du RE est un facteur sensibilisation pour l’induction de l’inflammation des ilots pancréatiques et de l’apoptose des cellules beta. Ceci pourrait fournir une explication mécanistique à l’augmentation parallèle observée de l’obésité infantile et de la fréquence du DT1.\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Précédemment, nous avons montré que la surexpression de l'échangeur Na/Ca NCX1), une protéine responsable de la sortie de calcium (Ca2+) des cellules, augmentait la mort cellulaire programmée ou « apoptose » et réduisait la prolifération des cellules β. Afin d’étudier plus en profondeur le rôle de l’échangeur dans les cellules β in vivo, nous avons développé et caractérisé des souris présentant une inactivation de NCX1.<p>Des méthodes biologiques et morphologiques (imagerie du Ca2+, capture de Ca2+, métabolisme du glucose, sécrétion d'insuline et morphométrie par comptage de points) ont été utilisées pour évaluer la fonction de la cellule β in vitro. Les taux de glucose et d'insuline dans le sang ont été mesurés afin de déterminer le métabolisme du glucose et la sensibilité à l’insuline in vivo. Des îlots ont été transplantés sous la capsule rénale pour évaluer leur capacité à corriger le diabète chez les souris rendues diabétiques par l’alloxane.<p>L'inactivation hétérozygote de Ncx1 chez les souris provoque une augmentation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose avec un renforcement important à la fois de la première et de la deuxième phase. Ces résultats s’accompagnent d’une augmentation de la masse et de la prolifération des cellules β. La mutation augmente également le contenu en insuline, l’immunomarquage de la proinsuline, la capture de Ca2+ induite par le glucose et la résistance à l'hypoxie des cellules β. En outre, les îlots de souris Ncx1+/- montrent une capacité à compenser le diabète 2 à 4 fois plus élevé que les îlots de souris Ncx1+/+ lorsque transplantés chez des souris diabétiques.<p>En conclusion, l’inactivation de l'échangeur Na/Ca conduit à une augmentation de la fonction de la cellule β, de sa prolifération, de sa masse et de sa résistance au stress physiologique, à savoir à divers changements de fonction des cellules β opposés aux principales anomalies rencontrées dans le diabète de type 2 (Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM). Ceci nous procure un modèle unique pour la prévention et le traitement du dysfonctionnement des cellules β dans le T2DM et pour la transplantation d'îlots.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In type 1 diabetes (T1D) a combination of genetic predisposition and environmental factors triggers islet inflammation (insulitis) leading to a selective and gradual destruction of the pancreatic beta cells. Beta cells mainly die through apoptosis, triggered at least in part by pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, TNF-α and IFN-γ. Recent findings suggest that the mitochondrial pathway of cell death is involved in this death cascade. Array analysis indicated that TNF-α+IFN-γ induces transcription factors such as NF-ĸB, STAT1, and AP-1 in beta cells. We presently aimed to examine the pathway(s) of apoptosis triggered by TNF-α+IFN-γ in beta cells. <p>TNF-α+IFN-γ induces beta cell apoptosis through the intrinsic pathway of cell death. This involved activation of the BH3 only proteins DP5, PUMA and Bim. Knockdown (KD) of either DP5 or PUMA or both led to a partial protection of INS-1E cells (12-20%), while silencing Bim led to about 60% protection against cytokine-induced apoptosis. Bim is transcriptionally induced by activated STAT1. TNF-α+IFN-γ also induces downregulation of Bcl-XL, an anti-apoptotic Bcl-2 gene which inhibits Bim. Knocking down Bcl-XL alone led to increase in apoptosis, but this was prevented by the parallel KD of Bim.<p>The ultimate goal of our research is to protect beta cells from the autoimmune assault. Previous data revealed that JunB inhibits ER stress and apoptosis in beta cells treated with IL-β+IFN-γ. Here, TNF-α+IFN-γ up-regulated the expression of JunB which was downstream of activated NF-ĸB. JunB KD exacerbated TNF-α+IFN-γ induced beta cell death in primary rat beta cells and INS-1E cells. The gene networks affected by JunB were studied by microarray analysis. JunB regulates 20-25% of the cytokine-modified beta cell genes, including the transcription factor ATF3 and Bcl-XL. ATF3 expression was increased in cytokine-treated human islets and in vitro silencing of JunB led to >60% reduction in ATF3 overexpression. We confirmed direct JunB regulation of the ATF3 promoter by its binding to an ATF/CRE site. Silencing of ATF3 aggravated TNF-α+IFN-γ induced cell death in beta cells and led to the downregulation of Bcl-XL expression in INS-1E cells. Pharmacological upregulation of JunB using forskolin led to upregulation of ATF3 and consistent protection of these cells against cytokine-induced cell death, while genetic overexpression of JunB in mice increased ATF3 expression in the pancreatic islets and reversed the pro-apoptotic effects of cytokines on beta cells (±40 % protection). <p>As a whole, our findings indicate that TNF-α+IFN-γ triggers beta cell apoptosis by the upregulation of the pro-apoptotic protein Bim and downregulation of the Bcl-XL protein. These deleterious effects are at least in part antagonized by JunB via activation of ATF3. <p><p>Dans le diabète de type 1 (DT1), la combinaison de facteurs génétiques de prédisposition et de l'environnement déclenche l'inflammation des îlots de Langerhans (insulite) conduisant à une destruction sélective et progressive des cellules bêta du pancréas. Les cellules bêta meurent principalement d’apoptose, déclenchée au moins en partie par les cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules immunitaires comme l’IL-β, le TNF-α l’IFN-γ. De récentes découvertes suggèrent que la voie mitochondriale de la mort cellulaire jouerait un rôle dans la mort de ces cellules. L'analyse de réseaux de gène utilisant les biopuces d’ADN indique que l’association TNF-α+IFN-γ induit l’activation de facteurs de transcription tels que NF-ĸB, STAT1 et AP-1 dans la cellule bêta. Dans ce contexte, nous avons cherché à examiner les voies de l'apoptose déclenchées par le TNF-α+IFN-γ dans la cellule bêta. <p>En présence de TNF-α+IFN-γ les cellules bêta meurent par apoptose via la voie intrinsèque. L’activation des protéines pro-apoptotiques « BH3-seulement » dont DP5, PUMA et Bim étaient en cause de cette apoptose. Le « knockdown »1 (KD), de DP5 ou de PUMA, ou des deux en même temps conduit à une protection partielle des cellules INS-1E (12-20%), tandis que le KD de Bim conduit à environ 60% de protection contre l’apoptose induite par cette combinaison de cytokines. La transcription de Bim est induite par STAT1 activé. Parallèlement à la régulation positive de Bim, TNF-α+IFN-γ conduit à la régulation négative de la protéine Bcl-XL. Bcl-XL est une protèine anti-apoptotique de la famille de protèines Bcl-2 qui en general inhibe Bim. Réduire l’expression de Bcl-XL seul induit une augmention de l'apoptose, alors que le KD de Bim et Bcl-XL en parallèle empêche l'apoptose.<p>Le but ultime de notre recherche est de protéger les cellules bêta des agressions autoimmunitaires. Les données antérieures ont révélé que JunB inhibe le stress du réticulum endoplasmique et l'apoptose dans les cellules bêta traitées avec IL-β+IFN-γ. Nous avons observé que TNF-α+IFN-γ induit l'expression de JunB qui se produit en aval de NF-ĸB activé. Il est important de noter que l’inactivation de JunB par des agents interférants de l’ARN (siRNA) exacerbe la mort des cellules primaires bêta de rat et de cellules INS-1E induite par les cytokines. Les réseaux de gènes touchés par JunB ont été étudiés grâce a l'analyse en microréseaux. JunB règule 20-25% des gènes modifiés par des cytokines dans les cellules bêta, y compris le facteur de transcription ATF3 et Bcl-XL. L’expression d’ATF3 est augmenté dans les îlots humains traités avec les cytokines et la répression in vitro de JunB conduit à une réduction de >60% de l’expression d’ATF3. Nous avons confirmé la régulation d’ATF3 par JunB en montrant que JunB est directement lié au promoteur d’ATF3 via le site ATF/CRE. La diminution d’expression d’ATF3 en presence de TNF-α+IFN-γ a aggravé la mort cellulaire induite dans les cellules bêta et a conduit à la régulation négative de l'expression de Bcl-XL dans les cellules INS-1E. L’augmentation pharmacologique de JunB dans les cellules INS-1E par l’utilisation de forskolin a conduit à la régulation positive en aval d’ATF3 et par conséquente à la protection de cellules bêta vis-a-vis de effets indésirables des cytokines. Dans cette optique, la surexpression génétique de JunB dans le modèle Ubi-JunB de souris transgénique a conduit à une surexpression d’ATF3 dans les îlots pancréatiques et a permir d’inverser les effets pro-apoptotiques de cytokines sur la cellule bêta (protection ± 40%).<p>Globalement, ces résultats indiquent que TNF-α+IFN-γ déclenche l'apoptose des cellules bêta par la régulation positive du gène pro-apoptotique Bim et la régulation négative du gène anti-apoptotique Bcl-XL. Ces effets indésirables sont inhibé en partie par JunB via l’activation de ATF3.<p><p>1Pas d’équivalent en français. Signifie la réduction de l’expression d’un gène via utilisation d’un siRNA (agent interférant de l’ARN).<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The endoplasmic reticulum (ER) is the organelle responsible for synthesis and folding of secreted and membranous protein and lipid biosynthesis. It also functions as one of the main cellular calcium stores. Pancreatic beta-cells evolved to produce and secrete insulin upon demand in order to regulate blood glucose homeostasis. In response to increases in serum glucose, insulin synthesis represents nearly 50% of the total protein biosynthesis by beta-cells. This poses an enormous burden on the ER, rendering beta-cells vulnerable to agents that perturb ER function. Alterations of ER homeostasis lead to accumulation of misfolded proteins and activation of an adaptive response named the unfolded protein response (UPR). The UPR is transduced via 3 ER transmembrane proteins, namely PERK, IRE-1 and ATF6. The signaling cascades activated downstream of these proteins: a) induce expression of ER resident chaperones and protein foldases. Increasing the protein folding capacity of the ER; b) attenuate general protein translations which avoids overloading the stressed ER with new proteins; c) upregulate ER-associated degradation (ERAD) genes, which decreases the unfolded protein load of the ER. In severe cases, failure by the UPR to solve the ER stress leads to apoptosis. The mechanisms linking ER stress to apoptosis are still poorly understood, but potential mediators include the transcription factors Chop and ATF3, pro-apoptotic members of the Bcl-2 familly, the caspase 12 and the kinase JNK. <p>Accumulating evidence suggest that ER stress contributes to beta-cell apoptosis in both type 1 and type 2 diabetes. Type 1 diabetes is characterized by a severe insulin deficiency resulting from chronic and progressive destruction of pancreatic beta-cells by the immune system. During this autoimmune assault, beta-cells are exposed to cytokines secreted by the immune cells infiltrating the pancreatic islets. Our group has previously shown that the pro-inflamatory cytokines interleukin-1beta (IL1-beta and interferon-gamma (IFN-gamma), via nitric oxide (NO) formation, downregulate expression and function of the ER Ca2+ pump SERCA2. This depletes beta-cell ER Ca2+ stores, leading to ER stress and apoptosis. Of note, IL1-beta alone triggers ER stress but does not induce beta-cell death, while IFN-gamma neither causes ER stress nor induces beta-cell death. Together, these cytokines cause beta-cell apoptosis but the mechanisms behind this synergistic effect were unknown.<p>Type 2 diabetes is characterized by both peripheral resistance to insulin, usually as a result of obesity, and deficient insulin secretion secondary to beta cell failure. Obese patients have high levels of circulating free fatty acids (FFA) and several studies have shown that the FFA palmitate induces ER stress and beta-cell apoptosis.<p>In the present work we initially established an experimental model to specifically activate the ER stress response in pancreatic beta-cells. For this purpose, insulinoma cells (INS-1E) or primary rat beta-cells were exposed to the reversible chemical SERCA pump blocker cyclopiazonic acid (CPA). Dose-response and time course experiments determined the best conditions to induce a marked ER stress without excessive cell death (<25%).<p>The first goal of the work was to understand the synergistic effects of IL1-beta and IFN-gamma leading to pancreatic beta-cell apoptosis. Our group previously observed, by microarray analysis of primary beta-cells, that IFN-gamma down-regulates mRNAs encoding for some ER chaperones. Against this background, our hypothesis was that IFN-gamma aggravates beta-cell ER stress by decreasing the ability of these cells to mount an adequate UPR. To test this hypothesis, we investigated whether IFN-gamma pre-treatment augments CPA-induced ER stress and beta cell death. The results obtained indicated that IFN-gamma pre-treatment potentiates CPA-induced apoptosis in INS-1E and primary beta-cells. This effect was specific for IFN-gamma since neither IL1-beta nor a low dose CPA pre-treatment potentiated CPA-induced apoptosis in INS-1E cells. These effects of IFN-gamma were mediated via the down regulation of genes involved in beta cell defense against ER stress, including the ER chaperones BiP, Orp150 and Grp94 as well as Sec61, a component of the ERAD pathway. This had functional consequences as evidenced by a decreased basal and CPA-induced activity of a reporter construct for the unfolded protein response element (UPRE) and augmented expression of the pro-apoptotic transcription factor Chop. <p>We next investigated the molecular regulation of the Chop gene in INS-1E cells in response to several pro-apoptotic and ER stress inducing agents, namely cytokines (IL1-beta and IFN-gamma), palmitate, or CPA. Detailed mutagenesis studies of the Chop promoter showed differential regulation of Chop transcription by these compounds. While cytokines (via NO production)- and palmitate-induced Chop expression was mediated via a C/EBP-ATF composite and AP-1 binding sites, CPA induction required the C/EBP-ATF site and the ER stress response element (ERSE). Cytokines, palmitate and CPA induced ATF4 protein expression and further binding to the C/EBP-ATF composite site, as shown by Western blot and EMSA experiments. There was also formation of distinct AP-1 dimers and binding to the AP-1 site after exposure to cytokines or palmitate. <p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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